碳酸鈣復(fù)合載藥納米粒的制備與表征

谷峙樾 雷 宇 趙健輝 劉占軍

華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北唐山 063000

納米載藥系統(tǒng)作為一種新興的給藥方式，納米粒吸附或靜電力接合藥物在緩控釋藥物應(yīng)用上更有利[1]。無機空腔納米球作為藥用載體有很多好處，它們?nèi)菀字瞥纱_定大小的納米粒[2]，另外在合成上，無機空腔納米球比聚合物空腔納米粒易于合成且具有更高穩(wěn)定性，不易形成塌陷[3]。尤其是空腔結(jié)構(gòu)的碳酸鈣可以用作藥用載體和診斷標記物，如其它的空腔納米球一樣，它除了具有優(yōu)越的生物相容性外，還可生物降解，在體內(nèi)具有很好的酸度響應(yīng)性，不至于發(fā)生反應(yīng)和降解[4-6]。主要研究如何制備出更適宜載藥的碳酸鈣空腔納米球并進行載藥。海藻酸鈉是一種生物相容性很好的天然高分子。海藻酸鈉溶液可以與二價以上金屬離子形成鹽而凝固[7-9]。因此我們選擇海藻酸的鈉鹽來修飾碳酸鈣空腔納米粒來提高空腔納米粒的穩(wěn)定性。制備出的復(fù)合納米粒用激光粒度分析儀、TEM 對其進行表征測定納米粒徑[10-11]。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

十六烷基三甲基溴化銨（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；碳酸鈉（分析純，天津河西工業(yè)氣體有限公司）；氯化鈣（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司）；鹽酸阿霉素（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；高速離心機3K30（德國Sigma 公司）；不銹鋼加熱磁力攪拌器RET[艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司]；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9101.2（金壇市榮華儀器制造有限公司）；UPWS 超純水器UPWS-I-10T（杭州永潔達凈化科技有限公司）；真空干燥箱DZ-1BC（天津泰斯特儀器公司）；透射電子顯微鏡H-7650（日本HITACHI 公司）。

1.2 碳酸鈣空腔納米球的制備

（1）精確稱取0.1g 的十六烷基三甲基溴化銨加入到盛有100mL 去離子水的500mL 的燒杯中，將燒杯置于恒溫磁力攪拌器上恒溫30℃，600r/min，溶解20min，不斷攪拌加速溶解，攪拌使十六烷基三甲基溴化銨完全溶解至溶液無色。（2）取制備好的0.1mol/L Na2CO3溶液50mL，加入到上步所得的溶液中，繼續(xù)攪拌20min，維持反應(yīng)溫度和轉(zhuǎn)速均不變。（3）取制備好的0.1mol/L CaCl2溶液50mL，加入到上步所得溶液中，將溫度降至0，轉(zhuǎn)速緩慢升高到1200r/min，將氯化鈣溶液逐滴從旋轉(zhuǎn)中心至邊緣中間部位加入（若在旋渦中心處加入則轉(zhuǎn)速過低，會形成較大且不規(guī)則的碳酸鈣納米粒；若在邊緣處滴加則轉(zhuǎn)速過快容易附著在玻璃容器內(nèi)壁上降低了納米粒的均一性），滴加時間在30min 左右，滴加完成后繼續(xù)攪拌5min，反應(yīng)溫度一直維持在5℃以內(nèi)。（4）用離心機4000r/min 離心20min，得到沉淀，沉淀用50%乙醇洗滌3 次洗滌后繼續(xù)用離心機4000r/min 離心，放入干燥箱80℃干燥12h，在放入馬沸爐中150℃煅燒4h，收集[12]。（5）在固定十六烷基三甲基溴化銨的量，且碳酸鈉和氯化鈣的投料比為1 ∶1 后，探究了碳酸鈉濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.04、0.08mol/L 五組不同濃度實驗；在固定十六烷基三甲基溴化銨的量，投料比和濃度后進行了300、500、700、1000、1500r/min 五組不同轉(zhuǎn)速實驗；在固定十六烷基三甲基溴化銨的量，投料比，濃度和轉(zhuǎn)速后進行了0、10、20、40、60℃五組不同溫度的實驗，目的是探究碳酸鈣空腔納米粒的最佳制備條件。

1.3 透射電鏡觀察

將最佳條件下制備得到的碳酸空腔納米粒置于透射電鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。并觀察不同溫度條件下碳酸鈣空腔納米粒的結(jié)構(gòu)。

1.4 碳酸鈣空腔納米球的修飾及電位

選取納米粒形態(tài)較好的且分散性和均一性均不錯的進行載藥后，測量其載藥量。精密稱取0.1mg CaCO3空腔納米球凍干干燥粉，將其用超聲儀超聲分散于10mL 去離子水中，精密稱取0.1mg 海藻酸鈉，將其用超聲儀超聲分散于10mL 去離子水中，充分攪拌，使海藻酸鈉完全溶解。將納米球溶液滴加到海藻酸鈉溶液中，攪拌30min，300r/min，25℃，反應(yīng)結(jié)束之后4000r/min 離心20min，用去離子水洗滌兩次，采用冷凍干燥零下20℃干燥12h，收集[13]。分別取0.1mg 的碳酸鈣空腔納米粒、ALG-CaCO3-P53、ALG-CaCO3-DOX-P53、ALG-CaCO3-DOX 四 種 納米粒的Zeta 電位。

2 結(jié)果

2.1 激光粒度分析儀檢測結(jié)果及分析

2.1.1 不同濃度的粒徑 在十六烷基三甲基溴化銨的量和其他反應(yīng)條件不變情況下，碳酸鈉和氯化鈣的濃度分別在0.020mol/L 時所得到的碳酸鈣空腔納米球粒徑最小。見表1。

碳酸鈣空腔納米粒的粒徑在0.020mol/L 時相對較小。本研究開始已經(jīng)進行了碳酸鈉濃度和氯化鈣濃度濃度梯度從0.001 ～ 0.2mol/L 的測定，結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)濃度高于0.1mol/L 則粒徑過大，會產(chǎn)生團聚現(xiàn)象而且會持續(xù)不斷生成碳酸鈣沉淀而導(dǎo)致粒徑過大。

表1 不同濃度的粒徑

2.1.2 不同反應(yīng)轉(zhuǎn)速的粒徑 在十六烷基三甲基溴化銨的量和其他反應(yīng)條件不變情況下，反應(yīng)轉(zhuǎn)速在1000r/min 時所得到的碳酸鈣空腔納米球粒徑最小，之后還會在1000r/min 周圍進行研究探究出轉(zhuǎn)速最佳條件。見表2。

表2 不同反應(yīng)轉(zhuǎn)速的粒徑

2.1.3 不同反應(yīng)溫度的粒徑 碳酸鈣空腔納米粒的粒徑在20℃時相對較小。在十六烷基三甲基溴化銨的量和其他反應(yīng)條件不變情況下，反應(yīng)溫度在20℃時空腔納米球粒徑最小。見表3。

2.2 透射電鏡結(jié)果及分析

制得的碳酸鈣空腔納米粒其外觀圓整，呈球形或類球形顆粒狀分布，中間有明顯空腔，粒徑大致分布在（196±2）nm 左右，均一性良好且分散性良好。見圖1。

表3 不同反應(yīng)溫度的粒徑

在10、20、40℃均出現(xiàn)明顯的空腔結(jié)構(gòu)，在0、60℃時無明顯的空腔結(jié)構(gòu)，因為溫度較低時直接形成了碳酸鈣結(jié)晶，溫度較高時反應(yīng)過于劇烈，形成的碳酸鈣多為片狀結(jié)構(gòu)。見圖2。

圖1 透射電鏡照片

圖2 不同溫度下透射電鏡照片

2.3 碳酸鈣空腔納米球修飾后的粒徑及電位

相對于碳酸鈣空腔納米粒電位為(-10.08±0.17)mV，表面帶負電荷的海藻酸鈉修飾后的CaCO3-ALG-P53 和CaCO3-ALG-DOX-P53 納 米 粒 子 電位分別為（-27.20±0.75）mV 和（-21.53±0.24）mV，經(jīng)海藻酸鈉修飾后電位明顯降低，穩(wěn)定性更好。P53 作為帶負電的質(zhì)粒其也增加了復(fù)合納米粒的負電從而使其更穩(wěn)定，但P53 所帶電荷相對較少因此對整體電位的影響并不多。見表4 ～ 5。

表4 納米粒載藥后的粒徑

表5 不同載藥種類的電位

3 討論

本研究開始進行了碳酸鈉濃度和氯化鈣濃度濃度梯度從0.001 ～ 0.2mol/L 的測定，結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)濃度高于0.1mol/L 則粒徑過大，在超過0.1mol/L 濃度之后因為濃度過大因此快速生成碳酸鈣結(jié)晶沉淀，同時會產(chǎn)生團聚現(xiàn)象而且會持續(xù)不斷生成碳酸鈣沉淀，因此產(chǎn)生的碳酸鈣納米粒壁過厚再加上多個碳酸鈣納米粒團聚在一起由碳酸鈣結(jié)晶粘附在一起，而導(dǎo)致粒徑過大。當(dāng)濃度低于0.01mol/L 時，其在十六烷基三甲基溴化銨表面結(jié)晶不完全，在表面無法形成完整的碳酸鈣空腔納米球，大多呈現(xiàn)長條狀或半圓狀，因此其粒徑測量平均值雖然為465.0nm，但測量值是由布朗運動等效而來的，其真實粒徑值并沒有如此大，但是足以證明其形成的結(jié)晶沉淀不規(guī)則且均一性不好，因此最佳濃度為0.020mol/L。通過探究了反應(yīng)轉(zhuǎn)速500、1000、1500r/min 三組不同轉(zhuǎn)速實驗，對其最佳的反應(yīng)轉(zhuǎn)速進行了研究，由表2 可知碳酸鈣空腔納米粒在1000r/min 的時候納米粒粒徑相對較小，當(dāng)反應(yīng)轉(zhuǎn)速為500r/min 較低時其粒徑平均值為363.7nm，溶液滴入到十六烷基三甲基溴化銨溶液后其反應(yīng)是不完全的，溶液中離子濃度分布不均，因此導(dǎo)致形成的碳酸鈣納米粒的均一性不好而且容易形成顆粒較大的碳酸鈣納米粒。當(dāng)反應(yīng)轉(zhuǎn)速為1500r/min 過高時其納米粒徑平均值為212.1nm,由于包裹物十六烷基三甲基溴化銨在去離子水中轉(zhuǎn)速過高是會產(chǎn)生泡沫，因此當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時加入的氯化鈣溶液會殘存于表層，導(dǎo)致反應(yīng)不完全，而且表面形成的碳酸鈣納米粒過大不合標準。探究了0、10、20、40、60℃五組不同溫度的實驗，對其最佳的反應(yīng)溫度進行了研究，由表3和圖2 可知碳酸鈣空腔納米粒的粒徑在20℃的時候相對較小。當(dāng)溫度為0 時其納米粒徑平均值為210.0nm，雖然其納米粒徑不大但是其透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其形成的納米粒不規(guī)則，多見單獨存在的碳酸鈣結(jié)晶沉淀，圍繞在較大納米粒周圍會有諸多小的結(jié)晶晶體結(jié)構(gòu)；當(dāng)溫度為60℃時其納米粒徑為308.5nm，由于反應(yīng)快速進行，因此所形成的的碳酸鈣納米粒壁薄厚不一，其物理穩(wěn)定性不穩(wěn)定高溫過程中易出現(xiàn)破碎的現(xiàn)象，納米粒碳酸鈣結(jié)晶壁較厚載藥量也相對較低，因此20℃為最佳的制備溫度，此溫度下制備的碳酸鈣空腔納米粒物理性質(zhì)穩(wěn)定，空腔壁薄厚適中載藥量相對較大，納米粒徑相對較小有助于其在體內(nèi)的代謝。

由表4 可以看出相對于碳酸鈣空腔納米粒，CaCO3-ALG-P53 和CaCO3-ALG-DOX-P53 的復(fù)合納米粒粒徑變大，負載了鹽酸阿霉素之后其粒徑會較之前變大。由表5 可以看出Zeta 電位，相對于碳酸鈣空腔納米粒，表面帶負電荷的CaCO3-ALG-P53和CaCO3-ALG-DOX-P53 納米粒子電位明顯降低，穩(wěn)定性更好。加入鹽酸阿霉素后，相比CaCO3-ALG-P53 納米粒子，CaCO3-ALG-DOX-P53 納米粒子粒徑變大，由于阿霉素帶正電，使得整個納米粒子的電位稍微升高一些，但負電荷依舊較高對其穩(wěn)定性影響不大。因此海藻酸鈉的引入增加了碳酸鈣空腔納米粒的穩(wěn)定性使其能夠負載藥物而且穩(wěn)定存在。

鹽酸阿霉素可以插入堿基對之間形成一種較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而使癌細胞停止轉(zhuǎn)錄而死亡從而達到殺死癌細胞的目的，加入鹽酸阿霉素后，相比CaCO3-ALG-P53 納米粒子，CaCO3-ALGDOX-P53 納米粒子粒徑變大，由于阿霉素帶正電，使得整個納米粒子的電位稍微升高一些，但負電荷依舊相對較高對其穩(wěn)定性影響不大。因為碳酸鈣納米粒在高溫條件下可以去除有機物殘留，同時會讓碳酸鈣納米粒表面形成多孔結(jié)構(gòu)，大量的納米孔徑可以使得基因藥物P53 通過毛細管力更好的負載進入到碳酸鈣空腔納米粒內(nèi)部[14-15]。同時海藻酸鈉與鈣的交聯(lián)作用粘附在納米粒表面，所帶負電荷可以對帶正電的鹽酸阿霉素進行吸附，其對帶正電的吸附力可以保證復(fù)合納米粒在機體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的釋放。