瑞芬太尼對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

張貝蕾 廖秀玉▲ 林建東 劉名法 吳 越 楊閩霞

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，福建福州 350005；2.福州長(zhǎng)樂(lè)區(qū)醫(yī)院內(nèi)科，福建福州 350200

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）在膿毒癥中非常常見(jiàn)，也是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)室患者死亡的首要原因。瑞芬太尼是一種μ 受體激動(dòng)劑，目前被廣泛使用在ICU 危重患者的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛治療中，研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥時(shí)，瑞芬太尼有著抗炎的作用，但是其具體機(jī)制尚不清楚。本文擬通過(guò)ELISA 測(cè)定膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6 水平并測(cè)定肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD 活性及MDA 的水平，以闡明瑞芬太尼對(duì)膿毒癥急性肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

雄性清潔級(jí)Wistar 大鼠32 只，體質(zhì)量270 ～320g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。瑞芬太尼（規(guī)格：1mg，江蘇恒瑞制藥廠，H20030197），烏拉坦Urethane（Sigma-Aldrich），TNF-α 和IL-6 測(cè)試盒（solarbio 有限公司），MDA 和SOD 測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），脂多糖LPS（Escherichia coli O127：B8,Sigma，St. Quentin Fallavier，F(xiàn)rance）。

1.2 動(dòng)物分組和模型制備

大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，即對(duì)照組、ALI組、瑞芬太尼處理組、瑞芬太尼對(duì)照組（每組8 只）。采用LPS 誘導(dǎo)制備膿毒癥急性肺損傷模型，大鼠常規(guī)禁食6h，不禁飲。烏拉坦腹腔注射誘導(dǎo)麻醉大鼠，將其放置于變溫毯上俯臥，維持體溫（36±0.1）℃。除烏拉坦經(jīng)腹腔注射外，瑞芬太尼和LPS 均通過(guò)尾靜脈注射。具體給藥方式如下：ALI 組給予LPS 15mg/kg 尾靜脈注射（20min 注射完畢），對(duì)照組用相同量的生理鹽水代替；瑞芬太尼處理組，首先注射LPS 15mg/kg，20min 后給予瑞芬太尼（0.04mg/kg），40min 注射完畢。瑞芬太尼對(duì)照組先給予與LPS 等量生理鹽注射，20min 后再給予瑞芬太尼（0.04mg/kg）40min 注射完畢。所有組予生理鹽水液體復(fù)蘇，總補(bǔ)液量為5mL/h，在2h 內(nèi)注射完畢。

1.3 標(biāo)本的留取

造模成功6h 后打開(kāi)胸腔，取右肺上葉，用濾紙吸干肺表面的水分，稱(chēng)濕重后，恒溫干燥箱85℃烘烤48h，稱(chēng)干重，計(jì)算W/D。右肺部分組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，行HE 染色，光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估；右肺部分組織，-80℃低溫冰箱保存，用于EILSA 檢測(cè)TNF-α、IL-6 的水平及MPO、SOD 檢測(cè)。

1.4 TNF-α、IL-6、MDA和SOD檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）檢測(cè)TNF-α和IL-6，具體按照操作試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD 的含量和活性，用硫代巴比妥酶法測(cè)定MDA 的含量，具體按照操作試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，肺組織中的SOD、MDA 含量按照公式計(jì)算，考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織TNF-α和IL-6的表達(dá)

LPS 注 射 后6h，LPS 致ALI 組 大 鼠 肺 組 織 中TNF-α 和IL-6 水平顯著高于對(duì)照組（P 均＜0.05），而瑞芬太尼處理組大鼠的TNF-α 和IL-6 平顯著低于ALI 組（P 均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺組織TNF-α和IL-6的水平 s，pg/mL）

表1 各組大鼠肺組織TNF-α和IL-6的水平 s，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與ALI 組比較，#P ＜0.05

2.2 大鼠肺組織SOD、MDA水平

與對(duì)照組相比，ALI 組肺干濕比明顯升高，肺組織勻漿MDA 水平升高，而SOD 水平顯著降低（P 均＜0.05），提示LPS 導(dǎo)致肺組織水腫，肺部受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度增加，而清除氧自由基的能力減弱。與ALI 組相比，瑞芬太尼處理組大鼠肺濕干比重、肺組織勻漿MDA 水平顯著降低，SOD 水平則顯著升高（P 均＜0.05），提示瑞芬太尼可以改善膿毒癥ALI 肺組織的抗氧化能力。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺濕干比重和肺組織MDA、SOD的水平

表2 各組大鼠肺濕干比重和肺組織MDA、SOD的水平

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與ALI 組比較，#P ＜0.05

2.3 病理學(xué)改變

肺臟的病理?yè)p傷輕重分度參照等SU 的方法評(píng)判。由兩位病理科醫(yī)師對(duì)每張切片隨機(jī)選擇在高倍視野進(jìn)行觀察。顯微鏡下急性肺損傷定義為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫、出血、透明膜形成、壞死和充血。肺損傷嚴(yán)重度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：（1）正常；（2）極輕度（＜25%）;（3）輕度（25%～49%）;（4）中度（50%～75%）；（5）重度（＞75%）。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺臟病理學(xué)評(píng)分，兩位醫(yī)師采用雙盲法的評(píng)分結(jié)果計(jì)算平均分后作為大鼠肺部損傷的病理評(píng)分。

ALI 組大鼠的肺組織體積増大，色澤暗紅甚至發(fā)黑，可有淡紅色血性液體滲出。肺組織石蠟切片HE 染色光鏡顯示（圖1 ～4），對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，肺泡腔清晰，腔內(nèi)無(wú)滲液，肺泡壁光滑,肺泡和肺間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。ALI 組肺組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，肺泡隔增寬，肺泡膨脹不全，部分塌陷或有肺泡融合，無(wú)法辨別肺泡結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞聚集，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞。而瑞芬太尼處理組大鼠的肺組織上述病理學(xué)改變則明顯減輕。

圖1 對(duì)照組肺組織病理學(xué)（HE 染色×400 倍）

圖2 瑞芬太尼對(duì)照組肺組織病理學(xué)（HE 染色×400 倍）

圖3 瑞芬太尼處理組肺組織病理學(xué)（HE 染色×400 倍）

圖4 ALI 組肺組織病理學(xué)（HE 染色×400 倍）

3 討論

在膿毒癥發(fā)展到全身臟器功能衰竭綜合征（MODS）的過(guò)程中，肺經(jīng)常是第一個(gè)受到累及的臟器[1-2]。膿毒癥相關(guān)的ALI/ARDS 起病迅速且極其危重，是膿毒癥發(fā)病率和死亡率最高的臨床綜合征[3]。超過(guò)50%的膿毒癥為革蘭氏陰性菌引起的,內(nèi)毒素是構(gòu)成革蘭氏陰性桿菌外膜的主要成分，能夠觸發(fā)一系列瀑布式級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子,具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)膿毒癥的能力。LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥模型是公認(rèn)的與臨床相關(guān)性較強(qiáng)的膿毒癥模型，廣泛用于膿毒癥發(fā)病機(jī)制的研究。本研究通過(guò)靜脈注射LPS 誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生膿毒癥急性肺損傷，發(fā)現(xiàn)ALI 組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，肺泡隔增寬，肺泡膨脹不全，部分塌陷或有肺泡融合，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞聚集。符合ALI 的病理學(xué)改變，而瑞芬太尼處理組大鼠的肺組織上述病理學(xué)改變則相對(duì)減輕。肺泡結(jié)構(gòu)破壞可見(jiàn)少量破壞，大部分結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)僅見(jiàn)輕微水腫，肺泡腔內(nèi)及間質(zhì)中紅細(xì)胞的滲出及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)均較ALI 組輕。

ALI 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為全身炎癥反應(yīng)在ALI/ARDS 的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[4-7]。內(nèi)毒素通過(guò)活化巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞，導(dǎo)致瀑布式的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生并釋放大量的炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素、TNF-α,導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管上皮細(xì)胞損傷，肺血屏障功能障礙，最終導(dǎo)致間質(zhì)性水腫與肺泡性水腫，以及肺泡內(nèi)透明膜形成，從而導(dǎo)致膿毒癥發(fā)展成ALI/ARDS。在ALI的發(fā)展過(guò)程中最主要的炎癥細(xì)胞因子包括TNF-α和IL-6[8]。TNF-α 是介導(dǎo)內(nèi)毒素休克、全身的炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、ARDS 和多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的重要起始因子[9-10]，其能導(dǎo)致通過(guò)使溶酶體受損導(dǎo)致酶外泄、刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、上調(diào)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞間粘附分子-1、促使白細(xì)胞遷移至炎癥部位、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成、釋放IL-1、IL-6、IL-8、釋放過(guò)氧化物和溶酶體,促進(jìn)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)花生四烯酸的代謝和脂類(lèi)介質(zhì)的產(chǎn)生,促進(jìn)微血栓形成等多種途徑導(dǎo)致肺損傷[11-13]。IL-6 也是一種重要的致炎炎癥因子，在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征患者肺部和血液中大量分泌，含量明顯高于健康人，能夠反應(yīng)肺組織的損傷程度。IL-6 參與巨噬細(xì)胞的分化和浸潤(rùn)，能夠通過(guò)激活補(bǔ)體及C 反應(yīng)蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)產(chǎn)生黏附分子,激活血管內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，參與時(shí)肺損傷的急性期反應(yīng)[14-15]。因此抑制細(xì)胞因的產(chǎn)生是治療炎癥性疾病的有效手段。本研究表明LPS 可以導(dǎo)致TNF-α 和IL-6 水平顯著升高，而瑞芬太尼能夠通過(guò)增加顯著降低促炎因子TNF-α和IL-6 的水平，減輕膿毒癥誘導(dǎo)的ALI。

在膿毒癥的發(fā)病及發(fā)展過(guò)程中，氧自由基所導(dǎo)致的氧化還原損傷是造成肺泡結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙的重要原因。在ALI/ARDS 的發(fā)病機(jī)制中機(jī)體特別是肺內(nèi)的氧化/抗氧化平衡失調(diào)起主要作用[16-18]。膿毒癥時(shí)大量氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化從而形成大量脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化物的一種，是氧化應(yīng)激和抗氧化劑狀態(tài)的標(biāo)志物，MDA 的量可以反應(yīng)機(jī)體受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。而SOD 是生物體內(nèi)氧自由基的天然清除劑，能清除體內(nèi)超氧陰離子、自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷, SOD 的高低可以間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。SOD 和MDA 聯(lián)合檢測(cè)能很好反應(yīng)氧化應(yīng)激狀態(tài),能夠代表組織損傷程度[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比ALI 組MDA顯著增加而SOD 下降，提示LPS 導(dǎo)致肺組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。而瑞芬太尼能夠上調(diào)SOD 并且降低MDA 的含量，提示瑞芬太尼可以通過(guò)減少氧自由基的產(chǎn)生并提高機(jī)體的抗氧化能力，抑制LPS 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，對(duì)ALI 有保護(hù)作用。

綜上所述，瑞芬太尼能夠通過(guò)減少抗炎細(xì)胞因子的的表達(dá)，并通過(guò)抗氧化應(yīng)激途徑對(duì)LPS 導(dǎo)致的ALI 起到保護(hù)作用。