屠宰場非洲豬瘟檢測

楊 娟1 楊忠蘋2

1.云南神農(nóng)肉業(yè)食品有限公司 云南昆明 650214 2.湖南國測生物科技有限公司 湖南長沙 410000

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性和致死性的傳染病[1，2]。該病感染率高，病死率可達(dá)100%，目前沒有有效的疫苗和藥物。該病自2018年8月1日，我國報告首例ASF發(fā)生以來[3]，疾病在國內(nèi)迅速傳播，目前在全國各省份都有發(fā)病案例，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了災(zāi)難性的影響[1,4]。

目前我國養(yǎng)豬業(yè)集約化水平偏低[5]，大量的散養(yǎng)戶分散在全國各地村鎮(zhèn)。而當(dāng)前我國動物防疫體系整體力量依然非常薄弱，尤其在廣大農(nóng)村地區(qū)，基層防疫人員匱乏，在非洲豬瘟嚴(yán)峻的防疫形勢之下，單純從養(yǎng)豬業(yè)入手，要保證我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展存在巨大的困難。

要做好非洲豬瘟防控，需要調(diào)動各方面的資源和積極性，從產(chǎn)業(yè)鏈各個環(huán)節(jié)入手。屠宰場作為生豬產(chǎn)業(yè)鏈的關(guān)鍵一環(huán)，是各地生豬匯聚之地，具有巨大的疫情傳播風(fēng)險；屠宰后的肉品流入到餐桌和下一個生產(chǎn)環(huán)節(jié)，也會持續(xù)的帶來疫情風(fēng)險。自去年至今，非洲豬瘟在我國快速擴散，一定原因在于私自屠宰發(fā)病豬和部分屠宰場管理不規(guī)范，被ASFV污染，通過生豬運輸車輛攜帶病毒擴散。

使用高靈敏度的檢測方法對待宰生豬進行宰前檢疫，做好屠宰場非洲豬瘟防控。第一，可以防止非洲豬瘟陽性豬流入食品和生豬深加工產(chǎn)業(yè)鏈，減小非洲豬瘟進一步擴散風(fēng)險；第二，可以倒逼上游規(guī)范采購和運輸環(huán)節(jié)，減少非洲豬瘟陽性豬銷售，降低非洲豬瘟病毒豬流通，加強運輸車輛消毒，減少運輸車輛傳播風(fēng)險；第三，通過進一步加強私屠濫宰整治，可以大大降低疫病擴散風(fēng)險，加強食品安全。加強屠宰場防疫是打好非洲豬瘟攻堅戰(zhàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對于整個非洲豬瘟防控具有重要意義。

加強檢測并對攜帶ASFV豬進行無害化處理是防控非洲豬瘟傳播的重要手段，如何選擇適合屠宰場使用的高效、快速、敏感、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的檢測方法，是屠宰場防疫的難題。為此，本文對ASF常用的檢測方法進行綜述，以期為一線ASF快速檢測，加強ASF防疫提供參考。

1 ASFV基因組檢測

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)作為一種經(jīng)典的分子生物學(xué)方法，也是目前動物傳染病領(lǐng)域使用最多的檢測方法之一。根據(jù)ASFV基因組高度保守區(qū)針對性的設(shè)計特異性引物，對目標(biāo)片段進行PCR擴增[6]，然后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸擴增產(chǎn)物，可以對ASFV病毒核酸進行檢測。檢測產(chǎn)物可以進一步測序或者酶切，提高檢測準(zhǔn)確性，并可以序列進行分析。

PCR方法應(yīng)用廣泛，但是作為一種必須持續(xù)使用的傳染病檢測方法，也具有其缺陷。第一，PCR方法檢測敏感性相對較高，但是依然有較大提升空間，在檢測混合樣是敏感性有所欠缺；第二，PCR操作步驟依然較為繁瑣，經(jīng)過核酸提取、擴增、電泳分析步驟[7]，在操作成過程中容易出錯，需要熟練的專業(yè)操作人員；第三，檢測時間依然較長，從樣本到出結(jié)果，完成全部檢測時間約需3h；第四，PCR方法使用瓊脂糖凝膠電泳開蓋點樣檢測結(jié)果時，擴增片段很容易形成氣溶膠污染實驗室，并容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

要做好PCR需在正規(guī)PCR實驗室里進行，需要配備PCR儀、凝膠成像儀及瓊脂糖凝膠電泳儀。屠宰場每天都需要檢測，在高強度的檢測情況下需要配備高標(biāo)準(zhǔn)的分子診斷實驗室，嚴(yán)格的區(qū)分試劑保存區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)，所有區(qū)之間通過壓差控制和傳遞窗使用杜絕氣流直接流通，不同分區(qū)嚴(yán)格使用不同的物品，才能相對有效的降低污染，減少假陽性結(jié)果發(fā)生。

綜上所述，傳統(tǒng)的PCR方法用于屠宰場一線ASFV的快速、準(zhǔn)確檢測有缺陷。

1.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。qPCR解決了常規(guī)PCR方法敏感性低[8]、需要電泳操作復(fù)雜、開蓋電泳易導(dǎo)致污染，操作時間偏長的問題，該方法敏感性高、特異性強[9]。通過配套便攜式的熒光PCR儀與免提取的試劑，可以在生產(chǎn)一線大量推廣使用，是目前非洲豬瘟防控生產(chǎn)實踐中最重要的方法之一[10]。

現(xiàn)有很多qPCR商業(yè)化試劑盒檢測非洲豬瘟病毒，操作簡單，檢測人員只需進行簡單的加樣后即可上機進行檢測，操作步驟少、對操作人員要求較低。

qPCR實驗室需要配置熒光定量PCR儀，對檢測結(jié)果進行實時監(jiān)控，能在1～1.5h檢測完畢，便攜式的熒光定量PCR儀也可以便捷的應(yīng)用到生產(chǎn)一線進行快速檢測。

qPCR檢測技術(shù)敏感性非常高，使得qPCR容易被污染，導(dǎo)致假陽性。這就要求實驗室的設(shè)計規(guī)范、實驗過程中的工作流向正確、實驗人員嚴(yán)格按照正規(guī)操作進行實驗，對氣溶膠污染的實驗室嚴(yán)格進行消毒。在實驗室檢測時應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分試劑保存區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸擴增區(qū)，各區(qū)域嚴(yán)格獨立，防止交叉污染；在生產(chǎn)一線操作時，應(yīng)該在完全獨立的房間和區(qū)域分開進行樣品處理、反應(yīng)體系配制和擴增工作。在實驗過程中需要引入陰性對照來監(jiān)控污染。

一線生產(chǎn)實驗所選用的熒光PCR儀應(yīng)該具有良好的性能。設(shè)備的升降溫速率決定了反應(yīng)時間；設(shè)備信號系統(tǒng)決定了檢測的靈敏度；設(shè)備移動應(yīng)不影響設(shè)備性能，免ROX校正；具備基線可調(diào)功能可以一定程度上減少假陽性問題。

總而言之，qPCR方法快速、準(zhǔn)確，配套性能優(yōu)異的檢測設(shè)備和簡便快速的免提取檢測試劑已經(jīng)成為非洲豬瘟病毒檢測的最重要的方法之一。

1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)[11](Loop-mediated isothermal amplificationL, LAMP)使用4條引物(特異識別靶序列上6個位點)及一種DNA聚合酶(具有鏈置換活性)，在等溫條件(60～65℃)下45min左右進行核酸擴增，其擴增效率可達(dá)到109～1010個數(shù)量級，能檢測到10拷貝質(zhì)粒DNA，具有靈敏度高、等溫擴增、操作簡單和檢測結(jié)果快速等優(yōu)點，在臨床檢測中有一定推廣前景[12，13]。

LAMP反應(yīng)過程中不需要昂貴的儀器[14]，只需恒溫水浴鍋即可，適合現(xiàn)場及野外使用該方法。結(jié)果讀取方面，可以使用濁度儀對反應(yīng)產(chǎn)物進行濁度分析，獲得陰陽性結(jié)果。目前多數(shù)LAMP檢測試劑盒在反應(yīng)體系中加入熒光染料，一旦檢測出陽性結(jié)果在紫外燈照下可以發(fā)出綠色熒光。

LAMP技術(shù)對引物設(shè)計要求較高，尤其是要獲得高度特異性的結(jié)果，存在一定難度。樣品處理、反應(yīng)和結(jié)果分析過程中也可能出現(xiàn)交叉污染，產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。這要求在實驗過程中嚴(yán)格分區(qū)，嚴(yán)格消毒，避免氣溶膠污染。

1.4 重組酶聚合酶擴增

重組酶聚合酶擴增技術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一種核酸等溫擴增技術(shù)[15]。該技術(shù)是2006年英國TwistDx Inc公司研發(fā)的，它最大的優(yōu)勢是可在25～43℃的恒溫下實現(xiàn)特定核酸序列的擴增，在5～20min觀察結(jié)果[16]。RPA技術(shù)對實驗室設(shè)備要求低，擴增操作簡單，僅需向反應(yīng)體系中加入提取好的核酸樣品模板及引物即可擴增。

RPA產(chǎn)物可通過結(jié)合探針(實時熒光定量RPA)或橫向流動試紙條(LFD)等方法實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的定量分析或可視化判別。RPA反應(yīng)試劑可以凍干形式保存，便于運輸及保存，適合現(xiàn)場和野外檢測。作為非洲豬瘟病毒的檢測，RPA技術(shù)有較大的優(yōu)化和應(yīng)用空間，作為一種操作簡便、檢測時間短、靈敏度較高、無需精密儀器的檢測技術(shù)[17]，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的快速分子診斷工具，可以在防疫現(xiàn)場檢測中推廣[18]。

2 ASFV抗體檢測

目前仍無有效的疫苗預(yù)防ASF，對于非洲豬瘟病毒抗體檢測不存在疫苗抗體干擾的問題[1]。感染ASFV強毒株的豬在產(chǎn)生抗體前已經(jīng)死亡，若檢測到ASFV抗體，通常表明是感染低毒力或中等毒力ASFV毒株，或者豬具備相應(yīng)抵抗力有一定幾率耐過。被ASFV感染初期的豬抗體檢出率低，甚至檢測不到抗體。但隨著疾病的持續(xù)、廣泛傳播，ASFV抗體檢出率可能越來越高，因此ASFV抗體檢測適應(yīng)于ASF帶毒篩查、ASF的復(fù)欄監(jiān)測，凈化階段檢測以及非AFS疫區(qū)國家的進口檢疫監(jiān)測。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA)是血清學(xué)檢測中常用的技術(shù)?？蓹z測血清和浸出液，該方法顯著特點是速度快、成本低，適用于大量樣本的快速篩查[19]，是國際貿(mào)易指定的檢測方法[1,8]。

ELISA方法可以根據(jù)需要，開發(fā)檢測ASF病原或者抗體的試劑盒。ELISA病原檢測試劑盒，該方法敏感性相對熒光PCR技術(shù)相對要低，但是好的ELISA試劑盒可以大幅度降低假陽性問題，ASFV抗原ELISA試劑盒可以作為一種輔助的監(jiān)測手段。

當(dāng)前還沒有非洲豬瘟疫苗，檢測出非洲豬瘟抗體即代表感染ASFV。部分ASFV感染耐過豬，體內(nèi)有ASFV抗體，但是病原下降，可能無法檢出ELISA抗原，甚至無法通過熒光PCR方法檢出核酸。在疫病防控過程中使用ELISA抗體檢測試劑盒進行篩查也有一定意義。

ELISA檢測方法操作較為簡單，需要使用酶標(biāo)儀，通常在實驗室由熟練的專業(yè)實驗人員來進行。

ELISA檢測感染ASFV后第一周內(nèi)的樣品，缺乏敏感性，因此該方法不適于作為早期檢測。但對于復(fù)欄監(jiān)測、凈化階段檢測以及進口檢疫監(jiān)測具有重要的作用。

2.2 間接熒光抗體試驗

間接熒光抗體試驗(Indirect Fluorecent Antibody Test, IFA)可用于檢測感染ASFV豬的血清、血漿或組織分泌物中的抗體。該技術(shù)的原理是用具有細(xì)胞適應(yīng)性的ASFV毒株，感染單層綠猴腎細(xì)胞，再通過特異性抗原抗體反應(yīng)實現(xiàn)對ASF抗體的檢測。在熒光顯微鏡下，陽性樣本在感染細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)特異性的熒光[1]。IFA適用于無ASF流行地區(qū)檢測陽性的血清，以及經(jīng)ELISA檢測無法確定結(jié)果的血清確證試驗[20]。

IFA檢測結(jié)果比ELISA檢測準(zhǔn)確，但耗時長，且結(jié)果判定需要借助熒光顯微鏡。ASFV作為列入OIE傳染病名錄的重大傳染病，只有特殊的經(jīng)過國家許可的P3以上的實驗室才能操作ASFV病毒，該方法只能在極少數(shù)實驗室使用。

2.3 間接免疫過氧化物酶試驗

間接免疫過氧化物酶試驗(Immune Peroxidase Technique, IPT)是一種細(xì)胞免疫技術(shù)。在IPT反應(yīng)過程中，綠猴腎細(xì)胞被ASFV毒株感染。感染細(xì)胞先被固定，之后用作抗原以確定樣品是否存在針對ASF的特異性抗體。與FAT檢測一樣，IPT作為敏感、特異的快速檢測技術(shù)，適用于從血清、血漿或組織滲出液中檢測ASF抗體。FAT檢測技術(shù)因用了酶學(xué)顯色，結(jié)果判定比IFA更簡單[1]。

IPT對實驗人員要求很高，需要很豐富的經(jīng)驗，并且實驗步驟復(fù)雜，很難在基層實驗室進行。同時開展ASFV的IPT檢測也只能在極少數(shù)經(jīng)過授權(quán)的特殊實驗室才可以進行。

3 展望

非洲豬瘟在我國爆發(fā)以來，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，加強檢測，早發(fā)現(xiàn)、早處理成為防控該病的重要步驟。因此，實驗室檢測技術(shù)在防控非洲豬瘟中體現(xiàn)出至關(guān)重要的作用。目前，ASFV的檢測主要從病毒核酸和病毒免疫學(xué)兩方面進行。OIE推薦檢測ASFV的方法主要有PCR、qPCR、ELISA等。病毒核酸檢測，特別是qPCR在早期檢測中發(fā)揮著不可替代的作用?？贵w檢測可以了解ASFV感染、發(fā)生、發(fā)展的進程，但抗體只有在病毒感染至一定時期后才會檢測到，具有一定的滯后性。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，ASFV實驗室檢測方法不斷完善，進一步為生產(chǎn)實踐中ASFV檢測方法提供技術(shù)支持。

ASFV檢測方法多種多樣，各有優(yōu)缺點[13]。屠宰場對非洲豬瘟檢測方法的選擇應(yīng)注意以下三點：第一，選擇快速、準(zhǔn)確、敏感、操作簡便的檢測方法，比如qPCR；第二，應(yīng)選用兩種及以上的檢測方法，更準(zhǔn)確的判定是否攜帶ASFV；第三，對于出現(xiàn)ASF臨床癥狀的豬應(yīng)結(jié)合免疫學(xué)檢測。

皮之不存毛將焉附，當(dāng)前我國養(yǎng)豬業(yè)到了生死存亡的關(guān)頭。選用性能優(yōu)異的設(shè)備，敏感的方法對待宰生豬進行宰前檢疫，對感染動物進行緊急無害化處理，降低ASFV擴散，防止ASFV感染豬流向下一個環(huán)節(jié)，有效防控好非洲豬瘟，對于屠宰行業(yè)的持續(xù)良性發(fā)展具有重要意義。加強非洲豬瘟檢測，做好非洲豬瘟防疫是當(dāng)前屠宰企業(yè)的責(zé)任擔(dān)當(dāng)和社會價值體現(xiàn)。