薏苡黑穗病田間發(fā)病形態(tài)觀察及抗性鑒定

羅凱 黎青 楊成龍 王健 班秀芝 袁圓

摘要：薏苡（Coix lacryma-jobi L.）黑穗病是薏苡主產(chǎn)區(qū)主要病害之一，對其產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重的影響。采用田間人工接菌，通過對不同產(chǎn)地薏苡資源發(fā)病形態(tài)觀察和植物體內(nèi)酶活性變化規(guī)律的研究，分析薏苡資源的農(nóng)藝性狀與抗黑穗病的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，薏苡黑穗病潛伏期較長，發(fā)病的早期在分蘗期，并在葉片上產(chǎn)生瘤狀凸起，病原菌通過植株維管束轉(zhuǎn)移至植株生長點，最終在籽粒部位發(fā)病并表現(xiàn)出明顯性狀;通過田間鑒定對7份資源進行抗性分級，野生薏苡的抗病性明顯優(yōu)于栽培薏苡，廣西Y51對薏苡黑穗病的抗性較差;接菌處理超氧化物歧化酶（SOD）活性表現(xiàn)為先上升后下降趨勢，48 h后呈快速下降趨勢，最終SOD活性顯著低于對照未接種組，為選育抗黑穗病的新品種提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：薏苡黑穗病;SOD活性;人工接菌;農(nóng)藝性狀;抗性鑒定

中圖分類號： S435.19?文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0126-03

薏苡（Coix lacryma-jobi L. ）為一年生或多年生藥食兼用草本植物，被稱為“禾本科之王”，其種植面積逐年增加[1-2]。但在我國薏苡主產(chǎn)區(qū)內(nèi)薏苡黑穗病為主要病害，對其產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重的影響[3-4]。薏苡黑粉病病菌（Ustilago coicis Brefeld）屬擔(dān)子菌亞門黑粉菌目黑粉菌科，會引起薏苡的真菌性病害[5]，黑粉菌目可對薏苡、玉米、甘蔗、谷子等作物造成嚴重的經(jīng)濟損失[6-11]。薏苡主產(chǎn)區(qū)栽培品種單一，主要以農(nóng)家自留種為主，加上病原菌易產(chǎn)生變異，導(dǎo)致原有抗性品種抗病性喪失，對生產(chǎn)造成了嚴重的損失，致使薏苡產(chǎn)量減少30%～50%，最高可造成80%的減產(chǎn)量[11]。

目前對薏苡黑穗病的研究主要集中在對病原菌生物學(xué)特性[12]、發(fā)生條件[11]及防治工作[5]等方面，而對田間形態(tài)的系統(tǒng)性觀察以及該病害的早期鑒定缺乏系統(tǒng)性研究。通過研究發(fā)掘優(yōu)良抗性材料，并利用遠緣雜交使優(yōu)良性狀得到聚合，以豐富薏苡抗性材料的多樣性極其重要。本研究通過常規(guī)田間方法對不同產(chǎn)地薏苡資源進行抗病性鑒定并探尋薏苡黑穗病早期發(fā)病的時期以及田間發(fā)病形態(tài)表現(xiàn)與室內(nèi)生理變化的關(guān)聯(lián)性，以期為防治黑穗病以及抗薏苡黑穗病新品種的選育提供理論參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?薏苡種質(zhì)?7種供試薏苡種質(zhì)均由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所保存，詳見表1。

1.1.2?菌種

薏苡黑粉病菌粉由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所研究人員從貴州省興仁縣采集并保存。

1.2?試驗方法

1.2.1?田間接菌方法

在播種前1 d采用黑穗病菌粉拌種，每100 g種子接種0.5 g，每小區(qū)5 m2穴播，設(shè)3次重復(fù)，用100 g菌土（含0.5%黑穗病粉）嚴密覆蓋，保持一定的濕度，按正常田間管理，待病株癥狀明顯后統(tǒng)計發(fā)病率，第2年用0.8%菌土復(fù)鑒，根據(jù)2年的發(fā)病百分率確定抗黑穗病級別，抗性級分級標(biāo)準參考李戈等的評鑒方法[13]：植株發(fā)病率0為免疫（IM）;發(fā)病率1%～20%為高抗（HR）;發(fā)病率>20%～40%為中抗（MR）;發(fā)病率40%以上為感?。⊿）。

1.2.2?調(diào)查方法

于抽雄開花時測量株高、分蘗數(shù)、主莖粗并統(tǒng)計單株發(fā)病率，籽粒成熟時統(tǒng)計單株穗粒數(shù)。

1.2.3?超氧化物歧化酶（SOD）的測定

選高感薏苡種子Y51溫湯浸種20 s后置于培養(yǎng)皿中，加濾紙保濕，于25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，待種子胚芽萌出并伸長至1 cm時進行接種，接種量同田間試驗（0.5 g）。取樣時間為接種后0、12、24、36、48、72 h，共6次，以不接種的為對照。

SOD活性的測定方法：在盛有3 mL反應(yīng)混合液[在54 mL 0.014 5 mol/L DL-甲硫氨酸中加入用0.05 mol/L pH值為7.8的磷酸緩沖液配制的3 μmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，簡稱EDTA），2.25 mmol/L NBT（氮藍四唑）和60 μmol/L核黃素各2 mL，各溶液均在用前配制，避光放置]的試管中，加入SOD粗酶液，混合后照光10 min，迅速測定D560 nm值，以不加酶液的照光試管為對照。

1.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用DPS 8.01軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?薏苡黑穗病的田間發(fā)病形態(tài)觀察

薏苡黑穗病為系統(tǒng)性全株侵染病害，種子表面所攜帶的冬孢子在種子萌發(fā)過程由中上胚軸侵入，隨著植株的生長在植株體內(nèi)擴展后在籽粒中產(chǎn)生大量孢子[13]。由圖1看出，薏苡植株受黑粉菌侵染后，苗期無明顯的病斑;薏苡植株到分蘗期后在葉片上出現(xiàn)淡綠色或紫紅色（圖1-1、圖1-2）的瘤狀凸起，剝開后可見黑褐色的厚垣孢子粉;薏苡黑穗病在薏苡抽穗初期就表現(xiàn)出明顯的癥狀，由圖1-3可看出，出現(xiàn)畸形淡紅色穗粒，受害子房膨大并呈近圓形，頂端稍尖細，隨著植株生長，厚垣孢子粉由內(nèi)向外溢出（圖1-4），在籽粒的外部形成1層黑褐色的孢子粉，最后部分破裂散落大量的孢子粉（圖1-5）。薏苡黑穗病潛伏期較長，且在葉片與穗部都可形成黑粉包，病株多不結(jié)實而成菌癭。

2.2?薏苡種植資源的田間抗病性鑒定

對7份不同產(chǎn)地的薏苡連續(xù)2年的發(fā)病株進行統(tǒng)計，表2的統(tǒng)計結(jié)果表明，廣西品種Y51的單株發(fā)病率分別為 92.48%、94.44%，發(fā)病率最高，抗病等級為感?。⊿）;貴州野生薏苡（Y33）的單株發(fā)病率分別為2.41%、4.80%，發(fā)病率最低，抗病等級為高抗（HR）;貴州主栽品種興仁小白殼的單株發(fā)病率分別為29.97%、35.19%，抗病等級為中抗（MR）;貴州晴隆縣糯性Y19的單株發(fā)病率分別為59.03%、73.18%，抗病等級為感病（S）;其他產(chǎn)地薏苡的抗病等級均表現(xiàn)為高抗（HR）。

差異顯著性分析結(jié)果表明，第1年單株發(fā)病率最高的廣西品種薏苡Y51與其他處理間的差異均達到極顯著水平;貴州興仁小白殼與晴隆縣糯薏苡Y19兩者間差異不顯著，但兩者與其他處理達極顯著差異;貴州野生種Y33除與四川野生薏苡Y146在0.05水平上有顯著差異外，與其他處理間差異達極顯著水平;云南薏苡Y166與野生薏苡Y251、四川野生薏苡Y146三者間差異不顯著。第2年復(fù)鑒差異顯著分析表明，單株發(fā)病率以廣西薏苡Y51最高，均與其他處理間達顯著差異水平;貴州晴隆糯性薏苡Y51與貴州興仁小白殼間達極顯著差異水平;云南薏苡Y166與其他處理間差異極顯著;野生薏苡三者間差異不顯著。說明野生薏苡較其他處理對黑穗病表現(xiàn)出較好的抗性，另外復(fù)鑒單株發(fā)病率均較第1年有增加趨勢，這可能與冬孢子在土壤中越冬后再侵染植株的過程有關(guān)，但須進行相關(guān)研究驗證。

2.3?薏苡資源田間生長性狀的分析

由表3可知，平均株高以Y19最高，為207.03 cm，Y51最矮，為86.90 cm;Y51平均分蘗數(shù)最多，為12.67個，具較強分蘗性，興仁小白殼以4.67個表現(xiàn)為分蘗性最差;主莖粗以野生種Y33最粗，為2.27 cm，Y51主莖粗最細，為 0.30 cm;平均單株穗粒數(shù)以Y166最多，達230.2粒，最少的為Y251，平均單株穗粒數(shù)為114.4粒。

差異顯著性分析結(jié)果表明，興仁小白殼、Y19糯薏苡與黑穗病發(fā)病率最高的Y51三者間株高達極顯著差異，且與其他處理間差異均達到極顯著水平;野生種Y33與Y166株高差異不顯著，二者與Y251在0.05水平上有顯著差異;分蘗數(shù)Y51與Y146差異不顯著，均與興仁小白殼、Y251、Y166、Y19糯達極顯著差異，與Y33無顯著差異;主莖粗Y146、Y251二者間差異不顯著，但與其他各處理均達到極顯著差異。由田間生產(chǎn)性狀可知，栽培薏苡與野生薏苡在株高、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)上無明顯規(guī)律性，而主莖粗方差分析結(jié)果表明，其與抗病性存在顯著差異，這是由所選取供試材料的田間生長性狀差異所造成的，與植株抗病性并無關(guān)聯(lián)性。

2.4?薏苡黑穗病菌接種后植株體內(nèi)SOD活性的動態(tài)變化規(guī)律

超氧化物歧化酶的生理作用是歧化 O-2·產(chǎn)生H2O2和O2，[CM（24*3]作為植物細胞內(nèi)防御酶系統(tǒng)中的重要成員，其變化規(guī)律可作為植物與病原菌互作過程的重要參考依據(jù)[14]。由圖2可知，薏苡種子胚芽軸未接種處理的SOD活性在0～24 h呈先升高后降低的趨勢，24～72 h隨著胚芽軸生長呈持續(xù)上升趨勢;接種處理的SOD活性在 0～36 h呈上升趨勢，36～48 h呈略微下降趨勢，48 h后呈快速下降趨勢，最終SOD活性明顯低于對照未接種組。可以看出，在接種前期未接種處理的SOD活性高于接種處理，24 h后酶活性呈上升趨勢，推測此時病菌菌絲開始接觸寄主，36～48 h成功侵入寄主完成侵染的過程，這與黃思良等報道的接種2 d后在薏苡胚芽鞘的橫向切片中證實病菌侵入寄主的研究結(jié)果[12]相吻合。

3?結(jié)論與討論

薏苡黑穗病是一種系統(tǒng)性侵染病害，病菌侵染主要集中在種子發(fā)芽至不完全葉抽出前的幼苗期，病菌主要從嫩胚芽鞘表皮細胞的凹陷部分形成并在該部位侵入，侵染寄主后的菌絲朝維管束方向擴展[12]，隨后轉(zhuǎn)移至生長點，在植株中潛伏一定時間后先在分蘗期薏苡葉片上形成少數(shù)淡綠色或多數(shù)紫紅色的瘤狀凸起，在穗分化初期將表現(xiàn)出明顯癥狀，最終在薏苡雌蕊、雄蕊中大量增殖，形成散落的黑色孢子的過程。通過對田間不同薏苡資源的抗病性鑒定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地薏苡資源對黑穗病表現(xiàn)出不同的抗病性，廣西Y51表現(xiàn)為高感薏苡黑穗病，其中野生薏苡較栽培薏苡對黑穗病表現(xiàn)出良好的抗性，為選育高抗薏苡黑穗病新材料與優(yōu)良的基因篩選提供了良好的理論支撐。另外對薏苡田間農(nóng)藝性狀的研究表明，其株高、分蘗數(shù)、單株穗粒數(shù)與發(fā)病率間無明顯相關(guān)性，與李戈等的研究結(jié)果[13]相吻合。但在研究過程中發(fā)現(xiàn)，莖粗指標(biāo)與黑穗病抗病性間存在一定的關(guān)聯(lián)性，但在生產(chǎn)上實則無關(guān)，其原因可能是本試驗選用的供試薏苡材料較少而導(dǎo)致統(tǒng)計結(jié)果誤差，所以應(yīng)增加抗黑穗病薏苡新材料的鑒選樣本。

植物在抵御病原菌侵入的過程中，寄主防御酶發(fā)揮了重要的作用，其中SOD是植物體內(nèi)與抵抗病原微生物侵染有關(guān)的重要酶系之一[14]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物受到病原菌侵害后，體內(nèi)會積累大量活性氧（ROS，如H2O2、·OH等），同時誘導(dǎo)植物產(chǎn)生主動防御反應(yīng)，產(chǎn)生如SOD、CAT（過氧化氫酶）、POD（過氧化物酶）等酶類，清除細胞內(nèi)的活性氧[15]。Montalbini等發(fā)現(xiàn)，受煙草普通花葉病毒（tobacco mosaic virus，簡稱TMV）病害侵染時，葉片組織中SOD活性上升[16]。本研究結(jié)果表明，植株受黑穗病病菌侵染后SOD的活性表現(xiàn)為先上升后下降，侵染后植株SOD活性明顯高于未接菌對照處理，但48 h后SOD活性又低于未接菌對照處理，可見植株受病害侵染后 O-2·在細胞積累會促進SOD合成酶基因的表達，SOD活性呈上升趨勢，而過多 O-2·的積累可能會造成受害植株體內(nèi)SOD防御酶體系崩潰，導(dǎo)致酶活性急劇下降。

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