芒果MinSPP基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

白蓓蓓 荊永琳 蔡秉宇 藍(lán)麗 李倩 趙志常 陳業(yè)淵

摘要：磷酸蔗糖磷酸酶（sucrose phosphate phosphatase）是合成蔗糖的關(guān)鍵酶，為了研究其在芒果果實中蔗糖合成的作用機(jī)制，從芒果果肉中克隆得到1個與蔗糖合成相關(guān)的基因，將其命名為MinSPP，其cDNA全長序列為1 561 bp，開放閱讀框為1 275 bp，編碼424個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為48.46 ku，等電點為5.34，對MinSPP基因編碼的蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其與克萊門柚具有較近的親緣關(guān)系。采用qRT-PCR對該基因在后熟處理的貴妃芒果肉中的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示從青熟期到成熟期芒果果肉中該基因表達(dá)量逐漸上升，從成熟期到完熟期芒果果肉表達(dá)量逐漸降低，其中成熟期芒果果肉中表達(dá)量較高。本研究深入了解了芒果蔗糖合成的分子機(jī)制，進(jìn)一步構(gòu)建了pBI121-MinSPP過表達(dá)載體，為MinSPP的功能鑒定奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：芒果;MinSPP基因;分子機(jī)制;蔗糖合成;甜度;克隆;表達(dá)載體構(gòu)建

中圖分類號： S667.701?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0103-05

在高等植物中蔗糖是光合作用的產(chǎn)物，在植物的生長、發(fā)育、儲存、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有運(yùn)輸糖的核心作用[1-2]。蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，簡稱SPS）和磷酸蔗糖磷酸酶（sucrose phosphate phosphatase，簡稱SPP）是蔗糖合成中的關(guān)鍵酶[3]，且2種酶都已定位于光合作用和儲存細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中[4-6]。蔗糖合成途徑是以二磷酸尿苷葡糖（UDP-Glc）和6-磷酸果糖（F6P）為底物，蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化生成6-磷酸蔗糖（S6P），6-磷酸蔗糖（S6P）在磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）催化下水解形成蔗糖和磷酸根離子[7-8]。其中SPS的催化反應(yīng)是可逆的，在最后一步中SPP的催化反應(yīng)是不可逆的，而SPS和SPP又是以復(fù)合物的形式存在的，所以認(rèn)為SPS和SPP共同催化蔗糖合成反應(yīng)是不可逆的[9-10]。

磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）既是催化蔗糖合成途徑的最后一步，也是光合碳同化途徑中的最后一個酶[11-12]，與SPS相比有關(guān)SPP的研究報道相對比較少。相關(guān)研究表明，在植物體內(nèi)SPS和SPP是以復(fù)合體的形式存在的，SPP催化生成 6-磷酸蔗糖（S6P）的同時二磷酸尿苷葡糖（UDP-Glc）存在時也能催化脫磷反應(yīng)，且SPP的活性遠(yuǎn)大于SPS，SPP可能在蔗糖合成過程中起重要的作用[13-15]。到目前為止，人們對芒果SPP基因的研究尚未見報道。由于SPP基因在蔗糖合成通路中有著舉足輕重的作用，影響可溶性糖的含量，本研究從芒果的果肉中克隆得到了1個MinSPP基因，并對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及對該基因的功能進(jìn)行研究，為芒果果肉蔗糖合成的作用機(jī)制及該基因?qū)馓鸲鹊挠绊懱峁├碚撘罁?jù)，為揭示該基因在芒果果肉蔗糖合成的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

本研究所用試材均取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所的農(nóng)業(yè)部儋州芒果種質(zhì)圃，以貴妃芒為試材。使用的試劑有TaKaRa PrimerSTAR Max DNA Polymerase、rTaq酶、克隆載體pEASY-Blunt、大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101等。

1.2?試驗方法

1.2.1?芒果果肉總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄

芒果果肉總RNA的提取參照天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行相關(guān)的操作，用于普通PCR的cDNA合成方法詳見北京全式金生物技術(shù)有限公司TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書。

1.2.2?MinSPP基因的克隆

根據(jù)前期已經(jīng)拼接得到的MinSPP基因的全長序列，設(shè)計上下游特異性引物擴(kuò)增MinSPP基因（表1）。PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA模板、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、10 μL TaKaRa PrimerSTAR Max DNA聚合酶和8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性 5 s;98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸8 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。連接pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化到Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌液送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測序。

1.2.3?MinSPP基因的生物信息學(xué)分析

利用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）上的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找MinSPP基因的開放閱讀框，并推測其氨基酸序列;運(yùn)用ExPASy ProtParam軟件（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析MinSPP蛋白理化性質(zhì);使用ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl？1）軟件分析氨基酸的疏水性與親水性;使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/Interactive）在線軟件預(yù)測并構(gòu)建MinSPP蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型;利用NCBI上的BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索MinSPP蛋白的同源序列;使用NCBI中的Conserved domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析MinSPP蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域;利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行同源序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4?qRT-PCR分析MinSPP基因相對表達(dá)量

利用 Bio-Rad公司CFX96實時定量PCR儀進(jìn)行試驗及數(shù)據(jù)分析。熒光定量所用酶為TransStart Tip Green qPCR SuperMix，反應(yīng)體系：1 μL模板，上下游引物（10 pmol/μL）各0.3 μL，5 μL SuperMix，3.4 μL ddH2O，樣品設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性7 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán);60 ℃ 30 s，20 ℃停止。溶解曲線在60～95 ℃下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。MinActin內(nèi)參基因和MinSPP基因熒光定量引物見表2。

1.2.5?MinSPP基因表達(dá)載體的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pEasyBlunt-MinSPP克隆載體和表達(dá)載體pBI121分別提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別將目的基因和酶切后的載體條帶進(jìn)行切膠回收。利用無縫克隆的方法將目的片段與載體進(jìn)行同源重組，反應(yīng)體系為：2 μL In-fusion同源重組酶，2 μL載體，5 μL目的片段，ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。然后50 ℃反應(yīng) 20 min，并迅速轉(zhuǎn)至冰上。轉(zhuǎn)化到Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌液擴(kuò)繁提質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切檢測，最后轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)，篩選陽性菌液，將菌液與50%甘油按照體積1 ∶1混合，于-80 ℃保存。

2?結(jié)果與分析

2.1?貴妃芒果果肉總RNA的提取

本研究提取貴妃芒果果肉總RNA，用核酸蛋白儀測定其濃度為800～1 000 ng/μL，純度D260 nm/D280 nm的比值為1.8～2.0，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有2條清晰完整的條帶（圖1）。

2.2?MinSPP基因全長的克隆

以貴妃芒果青熟期果肉cDNA為模板，以O(shè)RF兩側(cè)設(shè)計引物克隆得到MinSPP基因全長。利用ORF Finder分析得到基因CDS區(qū)為1 275 bp，編碼424個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為48.46 ku，等電點為5.34。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到目的片段約1 300 bp（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3?MinSPP基因序列、同源性、結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化樹分析

根據(jù)SPP基因編碼蛋白序列，在NCBI上利用BLASTP搜[CM（25]索并下載該蛋白的同源序列。選擇與MinSPP同源性較高的物種，分別為毛果楊（Populus trichocarpa）、克萊門柚（Citrus clementina）、麻瘋樹（Jatropha curcas）和巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis），與芒果MinSPP蛋白序列同源性分別為77%、77%、75%、73%，說明它們之間的親緣關(guān)系很近（圖3）。使用NCBI上的Conserved domains分析MinSPP蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示MinSPP基因含有PLN02382、SPP plant-cyano、S6PP、HAD_SPP、Cof共5個結(jié)構(gòu)域（圖4）。采用ProtParam Tool軟件對MinSPP蛋白的親水/疏水性進(jìn)行了分析（圖5），其中MinSPP蛋白的親水性平均系數(shù)的數(shù)值為-0.350，說明該蛋白為親水性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）計算為44.68，說明該蛋白質(zhì)分類為不穩(wěn)定。采用在線軟件預(yù)測MinSPP蛋白的三級結(jié)構(gòu)并構(gòu)建該蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型（圖6）。利用MEGA 7.0中ClustX多序列比對，鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），結(jié)果顯示，芒果SPP（Mangifera indica L.）與克萊門柚SPP（Citrus clementina）在同一分支上，說明它們之間的蛋白親緣關(guān)系較近。

2.4?芒果果肉在后熟處理中MinSPP表達(dá)量

利用qRT-PCR分析MinSPP在青熟期到完熟期（用乙烯催熟每間隔24 h取樣）果肉的表達(dá)量變化，結(jié)果如圖8所示。從柱狀圖中可以看出，MinSPP基因在芒果后熟處理5 d的相對表達(dá)量最高，在之后的完熟過程中MinSPP基因的相對表達(dá)量逐漸降低。

2.5?MinSPP基因表達(dá)載體的構(gòu)建

使用TaKaRa PrimerSTAR Max DNA聚合酶擴(kuò)增基因全長，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測且用膠回收試劑盒回收目的條帶，將pBI121空載體用KpnⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，1.0%瓊[CM（25]脂糖凝膠電泳檢測且用膠回收試劑盒回收目的條帶，然后用無縫克隆的方法連接2個回收后的條帶，構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-MinSPP，轉(zhuǎn)化到Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌液進(jìn)行擴(kuò)繁，之后提取pBI121-MinSPP重組質(zhì)粒，再用KpnⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切驗證，酶切目的基因片段為1 300 bp（圖9-A），與預(yù)期結(jié)果吻合，表明pBI121-MinSPP重組質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建成功。pBI121-MinSPP轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌，菌液PCR檢測到目的基因已成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株（圖9-B）。

3?討論與結(jié)論

在植物蔗糖合成過程中SPP無處不在，不管是藻類植物、裸子植物、被子植物還是在細(xì)菌中，都發(fā)現(xiàn)SPP存在[13，16-17]，也有研究表明，水稻、小麥和玉米的葉片中SPP活性和SPS活性相當(dāng)，它們都是以復(fù)合體的形式存在于植物中，因此SPP可能在蔗糖合成過程中發(fā)揮著重要的作用[14，18-19]。從芒果青熟期到完熟期各生育時期的變化可以明顯地看到SPP基因表達(dá)量的變化，說明在芒果果肉蔗糖合成過程中SPP也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而在芒果中SPS和SPP之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究與討論。

到目前為止，人們對于芒果中SPP基因研究甚少，本研究從芒果蔗糖合成途徑中的關(guān)鍵基因MinSPP進(jìn)行相關(guān)研究分析，發(fā)現(xiàn)在不同物種的同源序列比對中蛋白比對的一致性為85.61%，說明它們之間的親緣關(guān)系較近。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出，芒果MinSPP基因與克萊門柚CclSPP基因在同一分支上，說明它們之間的蛋白親緣關(guān)系較近。熒光定量分析芒果后熟過程中MinSPP相對表達(dá)量水平變化，結(jié)果顯示MinSPP在從青熟期到成熟期芒果果肉中的表達(dá)量逐漸上升的，從成熟期到完熟期芒果果肉中的表達(dá)量逐漸降低，其中成熟期芒果果肉中表達(dá)量較高。說明芒果在成熟期合成蔗糖含量較高，推測芒果從青熟期到完熟期對合成蔗糖含量的變化是從上升到下降的趨勢，從而可以印證在果實成熟過程中蔗糖的積累與SPP基因是有直接聯(lián)系的。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了pBI121-MinSPP重組過表達(dá)載體，對芒果蔗糖含量的功能變化還需要進(jìn)一步在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)進(jìn)行驗證，為研究MinSPP基因在芒果后熟過程中的作用機(jī)制提供理論支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]張明方，李志凌. 高等植物中與蔗糖代謝相關(guān)的酶[J]. 植物生理學(xué)通訊，2002，38（3）：289-295.

[2]王?晨，房經(jīng)貴，王?濤，等. 果樹果實中的糖代謝[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（5）：529-534.

[3]Cumino A，Curatti L，Giarrocco L，et al. Sucrose metabolism：Anabaena sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphate phosphatase define minimal functional domains shuffled during evolution[J]. FEBS Letters，2002，517（1/2/3）：19-23.

[4]Winter K，F(xiàn)oster J G，Edwards G E，et al. Intracellular localization of enzymes of carbon metabolism in Mesembryanthemum crystallinum exhibiting C3 photosynthetic characteristics or performing crassulacean acid metabolism[J]. Plant Physiology，1982，69（2）：300-307.

[5]Echeverria E，Salerno G. Intracellular localization of sucrose-phosphate phosphate in photosynthetic cells of lettuce（Lactuca sativa）[J]. Physiologia Plantarum，2010，88（3）：434-438.

[6]Echeverria E. Intracellular localization of sucrose-phosphate phosphatase in storage cells[J]. Physiologia Plantarum，2010，95（4）：559-562.

[7]劉凌霄，沈法富，盧合全，等. 蔗糖代謝中蔗糖磷酸合成酶（SPS）的研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種，2005，3（2）：275-281.

[8]唐朝榮，肖小虎，方永軍，等. 巴西橡膠樹磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表達(dá)模式分析[J]. 熱帶作物學(xué)報，2013，34（5）：855-859.

[9]Huber S C，Huber J L. Role and regulation sucrose-phosphate synthase in higher plants[J]. Annual Review Plant Biology，1996，47（2）：431-444.

[10]孫麗萍. 番茄果實蔗糖磷酸合成酶基因的克隆和番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[11]王計超. 蔗糖磷酸酶（OsSPP1）參與水稻磷信號調(diào)控功能研究[D]. 金華：浙江師范大學(xué)，2016.

[12]徐志華. 大豆蔗糖代謝相關(guān)基因GmCInv1和GmSPP1的克隆及功能分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[13]Hawker J S，Smith G M. Occurrence of sucrose phosphatase in vascular and non-vascular plants[J]. Phytochemistry，1984，23（2）：245-249.

[14]Lunn J E，Ashton A R，Hatch M D，et al. Purification，molecular cloning，and sequence analysis of sucrose-6（F）-phosphate phosphohydrolase from plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（23）：12914-12919.

[15]肖小虎. 巴西橡膠樹蔗糖代謝相關(guān)基因家族的克隆、結(jié)構(gòu)進(jìn)化和表達(dá)分析[D]. 海口：海南大學(xué)，2013.

[16]Page-Sharp M，Behm C A，Smith G D. Involvement of the compatible solutes trehalose and sucrose in the response to salt stress of a cyanobacterial Scytonema species isolated from desert soils[J]. Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects，1999，1472（3）：519-528.

[17]Porchia A C，Salerno G L. Sucrose biosynthesis in a prokaryotic organism：presence of two sucrose-phosphate synthases in Anabaena with remarkable differences compared with the plant enzymes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93（24）：13600-13604.

[18]Salerno G L，Echeverria E，Pontis H G. Activation of sucrose-phosphate synthase by a protein factor/sucrose-phosphate phosphatase[J]. Cellular and Molecular Biology，1996，42（5）：665-672.

[19]Echeverria E，Salvucci M E，Gonzalez P，et al. Physical and kinetic evidence for an association between sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphate phosphatase[J]. Plant Physiology，1997，115（1）：223-227.