骨筋丸膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

唐立海，朱壽光，林蔚文

（廣東省東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞 523808）

骨筋丸膠囊由乳香、沒(méi)藥、血竭等14味中藥組成，具有活血化瘀、舒筋通絡(luò)、祛風(fēng)止痛的功效。目前骨筋丸膠囊沿用的是《中藥成方制劑》第十三冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)［1］、《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編：骨傷科分冊(cè)》［2］及相關(guān)藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-B-2571-97-3、WS3-B-2571-97-6、WS3-B-2571-97-9、WS3-B-2571-97-12），除個(gè)別廠家注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)有檢測(cè)血竭含量外，其余均沒(méi)有檢測(cè)血竭的含量。在日常抽檢檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上大量存在以龍血竭冒充血竭使用的情況。血竭具有活血定痛，化瘀止血，生肌斂瘡功效，是骨筋丸膠囊中重要組成成分，目前我國(guó)血竭完全依賴從東南亞進(jìn)口，價(jià)格昂貴，質(zhì)量參差不齊。因此，在骨筋丸膠囊現(xiàn)有的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中增加血竭的含量測(cè)定，可以得出企業(yè)是否使用偽品投料、少投料、不投料等情況，滿足監(jiān)督生產(chǎn)企業(yè)對(duì)血竭投料不足或者使用劣質(zhì)血竭投料等情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津公司，型號(hào)：LC-20A）；色譜柱［資生堂（中國(guó)）投資有限公司，型號(hào)：MGII，4.6 mm×250 mm，5 μm］。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸等其他試劑為分析純。

1.3 試藥 骨筋丸膠囊 （黑龍江省濟(jì)仁藥業(yè)有限公司，批號(hào)：180101）；骨筋丸膠囊血竭陰性對(duì)照品（陜西君碧莎制藥有限公司，批號(hào)：20181021）；血竭素高氯酸鹽對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110811-201707，含量 96.3%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的考察

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品10 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加9%磷酸甲醇溶液（取9 mL磷酸，加水定容至100 mL，下同）稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2 mL置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)掃描 參照《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量測(cè)定”項(xiàng)下的血竭素高氯酸鹽的檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定波長(zhǎng)選擇定為440 nm。

2.1.3 流動(dòng)相的選擇 《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［3］2015 年版收載“血竭含量測(cè)定”項(xiàng)下的流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol／L 磷酸二氫鈉溶液（50∶50）。在此基礎(chǔ)上，改變流動(dòng)相的比例，選擇血竭素高氯酸鹽分離度、保留時(shí)間較適中的乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鈉溶液配比（30∶70），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 1。

2.2 供試品溶液提取條件的優(yōu)化 通過(guò)比較試驗(yàn)，選定的提取條件為：以9%磷酸甲醇25 mL為提取溶劑，超聲處理（功率240 W，頻率 40 kHz）30 min。

2.2.1 提取溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（磷酸甲醇濃度為1%、3%、6%、9%、12%時(shí)，面積積分值分別為441 323、534 766、742 861、764 072、765 319）表明：血竭素高氯酸鹽的提取效率與提取溶劑中磷酸的濃度有關(guān)，當(dāng)磷酸的濃度從1%逐漸提高至9%時(shí)，血竭素高氯酸鹽的含量逐漸提高，當(dāng)磷酸濃度提高至12%時(shí)，血竭素高氯酸鹽的含量不再提高，同時(shí)考慮磷酸甲醇的濃度太高，酸性太強(qiáng)，對(duì)儀器與色譜柱有損壞，故選擇9%磷酸甲醇作為提取溶劑。同時(shí)進(jìn)樣溶液用甲醇進(jìn)一步稀釋，以降低磷酸甲醇的濃度，參照《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量測(cè)定”項(xiàng)下的血竭素高氯酸鹽的供試品制備方法，擬定用甲醇稀釋5倍再上機(jī)進(jìn)樣。

2.2.2 提取方式的選擇 《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭”的提取方法為“振搖 3 min”，提取時(shí)間較短，且對(duì)振搖力度和強(qiáng)度未作具體要求。同時(shí)，血竭素高氯酸鹽存在對(duì)熱不穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（加熱回流 5、15、30 min，面積積分值分別為701 170、643 005、535 080）也表明：隨著加熱回流時(shí)間的增加，血竭素高氯酸鹽的含量逐漸降低。在比較不同超聲時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響，結(jié)果（超聲提取時(shí)間 5、15、30、60 min，面積積分值分別為678 550、708 970、768 535、768 940）表明：超聲 30 min和超聲60 min的結(jié)果一致，說(shuō)明血竭素高氯酸鹽提取完全，考慮實(shí)驗(yàn)操作的方便性，因此選用“超聲處理（250 W，40 kHz）30 min”的提取方式。

圖1 不同比例流動(dòng)相（乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鈉溶液）的HPLC圖

2.2.3 樣品稀釋倍數(shù)的選擇 供試品上機(jī)前的不同稀釋倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均一致，考慮稀釋倍數(shù)過(guò)大，峰面積過(guò)小，易引起較大誤差，因此選用上機(jī)前稀釋2倍的條件，即“……，取續(xù)濾液，再精密量取續(xù)濾液5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得”。

2.2.4 不同磷酸甲醇濃度對(duì)對(duì)照品的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（磷酸甲醇濃度為1%、3%、6%、9%、12%時(shí)，面積積分值分別為 535 146、531 677、537 705、538 886、537 243）表明：不同濃度的磷酸甲醇對(duì)血竭素高氯酸鹽對(duì)照品的溶劑及測(cè)定無(wú)影響，考慮不同酸度對(duì)色譜柱的影響，因此選用甲醇稀釋至刻度，即“取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品10 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加9%磷酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2 mL置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得”。

2.3 理論板數(shù)的選擇 結(jié)合不同色譜柱所測(cè)得的血竭素高氯酸鹽的理論板數(shù)，以及參照《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［3］2015 年版中的“血竭”，相關(guān)中成藥含量測(cè)定項(xiàng)下的血竭素高氯酸鹽理論板數(shù)的規(guī)定，故理論板數(shù)按血竭素高氯酸鹽峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.4 分析方法認(rèn)證 供試品溶液的制備：取供試品研細(xì)，每份精密稱定0.75 g，置具塞錐形瓶中，精密加入9%磷酸甲醇溶液25 mL，稱定重量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放置至室溫；再稱定重量，用9%磷酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

骨筋丸膠囊血竭陰性對(duì)照品溶液的制備：取不含血竭的陰性樣品0.75 g，余同供試品溶液的制備。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定，理論板數(shù)按血竭素高氯酸鹽計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.4.1 專屬性考察 按照上述色譜條件，吸取陰性對(duì)照溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液，分別注入色譜儀。結(jié)果血竭陰性供試對(duì)照品溶液的色譜在血竭素高氯酸鹽對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。供試品色譜主峰與相鄰峰分離度大于1.5，符合《中華人民共和國(guó)藥典（四部）》［4］2015 年版“通則 0512”的有關(guān)要求。

圖2 血竭素高氯酸鹽專屬性HPLC圖

2.4.2 線性關(guān)系的考察 參考文獻(xiàn)［5-6］，精密稱取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品適量，用9%磷酸甲醇制成每1 mL含血竭素高氯酸鹽0.369 022 mg的對(duì)照品溶液，再用依次稀釋到以下濃度：0.184 511、0.073 804、0.036 902、0.007 380、0.003 690、0.000 738 mg／mL。精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)、血竭素高氯酸鹽量（μg）為橫坐標(biāo)，在 0.007 38～3.690 22 μg 的范圍內(nèi)線性良好，得回歸方程為：Y＝1 544 1249.57X＋1 061.53，r＝0.999 9。表明在此范圍內(nèi)線性良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取已制備的對(duì)照品溶液，每次進(jìn)樣量為10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到血竭素高氯酸鹽面積的均值為369 335，RSD%為0.4，說(shuō)明儀器精密度好。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批骨筋丸膠囊樣品，按“2.4供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備6份，分別測(cè)定，每次進(jìn)樣量為10 μL，各供試品中血竭素高氯酸鹽平均含量為0.49 mg／粒，RSD%為0.6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本方法重現(xiàn)性較好，方法可行。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批骨筋丸膠囊樣品，按“2.4供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備，每次進(jìn)樣量為 10 μL，在 0～35 h 內(nèi)進(jìn)樣 10 次（0、2、4、8、12、16、 22、24、29、35），測(cè)得峰面積的 RSD%為 1.2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：供試品溶液在35 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取上述已知含量的骨筋丸膠囊9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入以下對(duì)照品溶液（每1 mL含血竭素高氯酸鹽0.016 81、0.024 65、0.030 97 mg）各25 mL，按含量測(cè)定項(xiàng)下操作，測(cè)得平均回收率為99.1%，RSD%為1.3。結(jié)果表明：骨筋丸膠囊用本法測(cè)定回收率良好。

2.4.7 不同色譜柱的考察 取同一供試品溶液，在不同廠家品牌的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱上測(cè)定，廠家分別為：資生堂（中國(guó)）投資有限公司，型號(hào)：MGII，4.6 mm×250 mm，5 μm；迪馬科技有限公司，型號(hào)：Diamonsil，4.6 mm×250 mm，5 μm；沃特世科技（上海）有限公司，型號(hào)：RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm。 結(jié)果：分離度均良好，RSD%為 0.9，測(cè)定結(jié)果基本一致。

2.5 樣品的含量測(cè)定 取57批次骨筋丸膠囊，按擬定的含量測(cè)定方法操作，測(cè)定。總共13個(gè)廠家，57個(gè)批次，其中有2個(gè)廠家4個(gè)批次未檢出血竭素高氯酸鹽（占7.02%），其余53批次檢出血竭素高氯酸鹽（占 92.98%），含量在 0.02～0.69 mg／粒，其中：23批次含量在 0.02～0.08 mg／粒（占 40.35%），18批次含量在 0.11～0.19 mg／粒（占 31.58%），4批次含量在 0.20～0.28 mg／粒（占 7.02%），1批次含量為 0.38 mg／粒（占 1.75%），4批次含量在 0.40～0.49 mg／粒（占 7.02%），3 批次含量在 0.60～0.69 mg／粒（占5.26%）。含量測(cè)定結(jié)果批間差異較大，推測(cè)骨筋丸膠囊中血竭素高氯酸鹽含量受原料藥材質(zhì)量或工藝的影響大。

2.6 限度擬定 根據(jù)上述53批樣品的測(cè)定結(jié)果，血竭素高氯酸鹽的含量在 0.02～0.69 mg／粒，按《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量測(cè)定”規(guī)定，血竭中血竭素高氯酸鹽的限度為1.377%。骨筋丸膠囊處方中，1 000粒骨筋丸膠囊的總投料量為913 g，其中血竭的投料量為27 g，因此每粒骨筋丸膠囊含血竭的量為29.57 mg，參考藥典規(guī)定的限度1.377%計(jì)算，每粒應(yīng)含血竭素高氯酸鹽0.40 mg。血竭是粉碎成細(xì)粉填充為膠囊劑，因此在生產(chǎn)過(guò)程中的損耗大為減少，同時(shí)考慮到保存期等不穩(wěn)定因素，以藥材含量的低限推算所訂的限度為 0.30 mg／粒。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)提取溶劑隨著磷酸濃度（1%～12%）的增加，血竭素高氯酸鹽的含量逐漸提高，且當(dāng)磷酸濃度提高至12%時(shí)，血竭素高氯酸鹽的含量不再提高。但隨著磷酸濃度的增加，血竭素高氯酸鹽的不穩(wěn)定性也隨之提高，這可能與血竭素結(jié)構(gòu)含有一個(gè)苯并吡喃環(huán)有關(guān)，這類化合物易受光熱、pH值影響，導(dǎo)致苯并吡喃環(huán)開(kāi)環(huán)形成相應(yīng)的查耳酮結(jié)構(gòu)［7］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用9%磷酸甲醇濃度提取時(shí)，血竭素高氯酸鹽在35 h內(nèi)較穩(wěn)定，滿足實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)，考慮血竭素高氯酸鹽存在對(duì)熱不穩(wěn)定性，因此采用超聲處理方式來(lái)提取。通過(guò)本研究所擬定的血竭素高氯酸鹽定量測(cè)定方法與《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［3］2015 年版“血竭”的測(cè)定方法比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所擬定的測(cè)定方法，血竭素高氯酸鹽的含量有了大幅提高。

按擬定的方法對(duì)57批骨筋丸膠囊樣品中血竭素高氯酸鹽的含量進(jìn)行測(cè)定，含量結(jié)果顯示各批間差異較大（按擬定的不得少于0.30 mg／粒的限度計(jì)算，合格率為14.06%，不合格率為85.96%），推測(cè)骨筋丸膠囊中血竭素高氯酸鹽含量受原料藥材質(zhì)量或工藝的影響大。兩個(gè)廠家4個(gè)批次未檢出血竭素高氯酸鹽，可能原因是廠家為節(jié)約成本，未使用血竭投料或者以龍血竭代替血竭投料。在血竭素高氯酸鹽含量測(cè)定中，13家生產(chǎn)企業(yè)，離散程度較大，批間差異均較大，說(shuō)明企業(yè)血竭來(lái)源及工藝均不穩(wěn)定。同時(shí)，同個(gè)廠家不同批次間測(cè)定結(jié)果差異較大，提示其投料量不足，推測(cè)有可能是廠家使用劣質(zhì)血竭或減少投料量所致。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：血竭具有抗炎、止痛、抗痢疾、止瀉、止血、抗?jié)?、抗菌和抗腫瘤等多種藥理活性［8］。近年來(lái)，血竭素高氯酸鹽作為血竭藥材的主要藥理活性指標(biāo)之一［9-10］，在細(xì)胞層面上的藥理活性逐漸被發(fā)現(xiàn)，因此血竭素高氯酸鹽含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)骨筋丸膠囊質(zhì)量控制及療效評(píng)價(jià)方面均具有重要意義。綜上所述，本研究建立的測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，可有效測(cè)定骨筋丸膠囊中血竭素高氯酸鹽的含量。