松郁安神方對肝郁失眠大鼠行為學及5-HT1A受體基因表達的影響

李璟怡 ，黃俊山 ，陳 沁 ，魏 敏 ，王海生 ，陳銘奇

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州350122；2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州350003；3.黃俊山福建省名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，福建 福州 350003；4.福建省中醫(yī)睡眠醫(yī)學重點實驗室，福建 福州 350003）

失眠是以頻繁而持續(xù)的入睡困難和（或）睡眠維持困難并導致睡眠感不滿意為主要特征的一類疾病，中國內(nèi)地成人有失眠癥狀者高達57%［1］。龐大的失眠群體中，以肝郁失眠患者最為多見，疏肝安神法成為治療失眠的常用方法［2-3］。黃俊山教授是第六批全國老中醫(yī)藥專家學術(shù)經(jīng)驗指導老師、福建省名中醫(yī)，在中醫(yī)藥防治失眠方面有深入的研究。松郁安神方是黃教授臨床治療失眠經(jīng)驗方，對肝郁失眠患者療效確切。5-羥色胺（5-HT）是公認的調(diào)節(jié)睡眠-覺醒與情志的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)之一，5-HT1A作為其中的一個亞型，參與睡眠、焦慮和抑郁等情緒的調(diào)節(jié)［4］。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）作為一種核內(nèi)調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮改善情緒及增強記憶的作用。研究表明，5-HT與CREB可作為肝郁氣滯證診斷及預后的潛在標志物［5］。本實驗旨在觀察肝郁失眠大鼠行為學及5-HT1AR與CREB的變化，進一步探討松郁安神方防治失眠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級 Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于恒溫（22±1）℃和 12∶12 固定照明節(jié)律（08∶00開燈）的環(huán)境下，并可自由攝取食物和水。

1.1.2 實驗藥物 ① 中藥松郁安神方由福建省中醫(yī)藥研究院提供并鑒定，符合《中華人民共和國藥典（一部）》［6］標準，組成及用量（按成人 60 kg 體質(zhì)量計算）：甘松 10 g，郁金 15 g，玫瑰花 10 g，生龍骨30 g，珍珠母 30 g，柴胡 10 g，丹參 15 g，酸棗仁 15 g。松郁安神方低劑量組（低劑量組）按成人用量6倍（8.5 g／kg）、松郁安神方高劑量組（高劑量組）按成人用量12倍（17 g／kg），由藥物室一次性煎煮取汁各500 mL，-20℃保存。② 鹽酸丁螺環(huán)酮片（北大醫(yī)藥股份有限公司，批號：H19990302）。

1.1.3 主要試劑 對氯苯丙氨酸（PCPA，美國Sigma公司）；RNeasy?Mini Kit提取試劑盒（德國Qiagen公司）；RevertaidTM第一鏈cDNA合成試劑盒（美國 Thermo ScienTific公司）；SYBR?Green qPCR試劑盒（美國 AppLied Biosystems公司）；10%Criterion?Tris-HCl凝膠（12＋2 well，45 μL）、全范圍精確分子量預染蛋白質(zhì)標準品（美國Bio-Rad公司）；5-HT1AR抗體、CREB抗體、WB二抗（中國博奧森公司）；SDS-PAGE 電泳液、Western 封閉液、Western一抗稀釋液、二抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；β-actin抗體（英國abcam公司）。

1.1.4 主要儀器 Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；熒光定量PCR儀（美國AppLied Biosystems公司）；超微量分光光度計、臺式冷凍離心機（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；多功能酶標儀（瑞士TECAN公司）；PCR儀、小型垂直電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、小型轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國WEALTEC公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 50只大鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、低劑量組、高劑量組和丁螺環(huán)酮組，每組10只。

1.2.2 肝郁失眠大鼠模型制造 采用該領(lǐng)域被廣泛認可的大鼠慢性夾尾刺激和PCPA腹腔注射復合制造肝郁失眠模型。除對照組外，其余4組先采用夾尾刺激法致肝郁：即將大鼠每籠5只喂養(yǎng)，用尖端包裹紗布的大彎止血鉗，夾住其中1只大鼠的尾巴，令其與籠中其他大鼠撕打，從而激怒全籠大鼠，令全籠大鼠處于對峙狀態(tài)，每次刺激30 min，2次／d，連續(xù)刺激1周，使大鼠感到郁怒不適而不得發(fā)，見情緒抑郁、胡須下垂、叫聲尖細，即符合肝郁表現(xiàn)。將PCPA溶于弱堿性生理鹽水中，配置成混懸液，以300 mg／（kg·只）對大鼠進行腹腔注射，1 次 ／d，連續(xù)2 d，觀察發(fā)現(xiàn)大鼠晝夜節(jié)律消失，白天夜晚活動不停，睡眠減少直至消失，進食及飲水增多，體毛凌亂無華，精神萎靡，再次刺激時，反抗明顯減弱，整體觀察與對照組明顯不同，表明造模成功［7-8］。

1.2.3 給藥方法 以下各組均按15 mL／kg體質(zhì)量灌胃，1次／d，共14 d。低劑量組按大鼠用量為成人6倍（成人按60 kg體質(zhì)量計算）劑量換算，8.5 g／kg松郁安神方煎汁灌胃；高劑量組是低劑量的2倍，按17 g／kg松郁安神方煎汁灌胃；丁螺環(huán)酮組用鹽酸丁螺環(huán)酮加蒸餾水配置成2.0 mg／kg混懸液（用量為成人6倍劑量）灌胃；對照組、模型組用等量生理鹽水灌胃。

1.3 觀察檢測指標

1.3.1 一般狀態(tài) 觀察大鼠的精神活動狀態(tài)、皮毛顏色是否有光澤、進食飲水量、對外界刺激的反應(yīng)及體質(zhì)量變化等。

1.3.2 曠場實驗 各組大鼠末次灌胃30 min后，在安靜、光強度溫和的條件下進行實驗。采用自制長×寬×高為75 cm×75 cm×40 cm的曠場箱，底面劃分為25個面積相等的小格，箱底和側(cè)壁為黑色。將各組小鼠分別置于曠場箱中央，拍攝并記錄5 min內(nèi)的水平活動得分（穿越底面格子數(shù)，四爪皆進入記為1分）、垂直活動得分（兩前爪離地1次記為1分）、糞便顆粒數(shù)。兩次實驗之間，清洗箱內(nèi)壁及底面，以免前面實驗動物余留的信息干擾后面實驗的結(jié)果。

1.3.3 Morris水迷宮實驗 加水至水深30 cm，水溫控制在24℃左右，逃逸平臺直徑10 cm，高度設(shè)置為24 cm。將各組大鼠面壁逐一放入水中，放入位置為第二象限標記處，錄像自動記錄大鼠逃避潛伏期（從入水到四肢爬上平臺所需時間）。造模第16天開始，1次／d，連續(xù)訓練5 d，第 6天撤除平臺正式測試，記錄1 min內(nèi)大鼠跨越平臺位置的次數(shù)。

1.3.4 取材 將實驗大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭，剪開頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側(cè)視神經(jīng)后用眼科鑷子冰上迅速取出大鼠的整個腦組織，分離海馬，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，置于-80℃保存待測。

1.3.5 檢測5-HT1AR、CREB mRNA表達量 在Trizol中研磨各組大鼠海馬腦組織，低溫離心15 min，吸取上清液，依次加入氯仿、異丙醇等提取總RNA；根據(jù)總RNA濃度和反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，反應(yīng)條件為：退火25℃，5 min；延伸 42℃，60 min；失活70℃，5 min。5-HT1AR mRNA上游引物：5’GGCTGTATATCTGCTCTATATGC 3’，下游引物：5’CCGCTTCCTTTGTCCATCAG 3’；CREB mRNA 上游引物：5’ GCCCTCAGTCTTGGAGTGTC 3’，下游引物：5’TAACACAGGGCGCCTAAGAG3’。進行qPCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參，校正每個樣品的Ct值，得ΔCt值。

1.3.6 檢測5-HT1AR、CREB蛋白表達量 用裂解液提取大鼠海馬腦組織蛋白，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配置合適濃度的分離膠；取45 μL樣品蛋白，電泳分離，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，浸泡封閉液中2 h后，分別加入一抗，比例1∶1 000，4℃孵育過夜；經(jīng)TBS洗滌，加入相應(yīng)二抗，比例1∶1 000，室溫孵育2 h，用TBS洗滌。化學發(fā)光劑A和B等體積混勻，顯影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，各組間比較采用單因素方差分析。組間兩兩比較，方差齊則采用Scheffe檢驗；方差不齊則采用Dunnett's T3法。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀態(tài)觀察 對照組大鼠精神狀態(tài)好，活動靈敏，毛發(fā)干凈有光澤，體質(zhì)量明顯增加。模型組大鼠神情倦怠，喜靜少動，易驚擾，毛發(fā)干枯、缺少光澤，飲食減少。高、低劑量組和丁螺環(huán)酮組的大鼠精神狀態(tài)、活動情況與模型組比較，有明顯改觀。

2.2 5組曠場實驗結(jié)果比較 見表1。

2.3 5組Morris水迷宮實驗結(jié)果比較 見表2。

2.4 5組大鼠海馬5-HT1AR、CREB mRNA表達比較 見圖 1、圖 2。

表1 5組大鼠曠場實驗結(jié)果比較（）

表1 5組大鼠曠場實驗結(jié)果比較（）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

組別對照組模型組低劑量組高劑量組丁螺環(huán)酮組n 10 10 10 10 10水平活動得分88.34±15.70 132.67±18.661）98.75±12.332）85.63±13.223）71.67±12.113）垂直活動得分18.83±6.70 22.57±4.621）19.21±5.022）16.68±3.212）17.05±5.312）糞便顆粒數(shù)1.92±1.75 4.32±2.121）3.09±1.63 2.35±1.972）2.34±1.132）

表2 5組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較（）

表2 5組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較（）

注：與對照組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組高劑量組丁螺環(huán)酮組n 10 10 10 10 10逃避潛伏／s 11.67±2.87 23.42±1.702）17.54±3.73 10.89±2.913）11.03±3.273）穿臺次數(shù)／次5.7±2.1 2.3±1.61）4.4±3.43）5.1±3.93）5.0±6.83）

圖1 5組大鼠海馬5-H1AR mRNA表達

圖2 5組大鼠海馬CREB mRNA表達

2.5 5組大鼠海馬5-HT1AR、CREB蛋白表達比較見圖3～圖5。

3 討 論

失眠治療以疏肝為主，疏肝以解郁藏魂，魂藏即能神安。黃俊山教授以疏肝安神法立方的松郁安神方以散肝郁、安心神為主，兼調(diào)氣血、暢情志，臨床療效確切。

圖3 5組大鼠海馬5-HT1AR、CREB蛋白表達電泳圖

圖4 5組大鼠海馬5-HT1AR蛋白表達

圖5 5組大鼠海馬CREB蛋白表達

海馬是與壓力相關(guān)的腦區(qū)之一，長期失眠會使海馬體積縮小，海馬區(qū)的CREB活性與5-HT1A受體激動劑與抗焦慮作用相關(guān)，海馬是研究睡眠一個明確且有意義的觀察位點［9-10］，位于海馬突觸上的5-HT1AR對于調(diào)節(jié)焦慮相關(guān)行為、改善睡眠是非常重要的［11］。

本實驗采用該領(lǐng)域被廣泛認可的大鼠慢性夾尾刺激和PCPA腹腔注射復合制造肝郁失眠大鼠模型［12］。曠場實驗是研究大鼠情緒反應(yīng)的常用方法，反映動物探索學習、恐懼警覺狀態(tài)的行為特征，其中水平活動得分和垂直活動得分反映大鼠的活躍性和興奮性，糞便顆粒數(shù)反映大鼠緊張狀態(tài)。模型組與對照組比較，前者水平活動、垂直活動得分、糞便顆粒數(shù)均明顯升高（P＜0.05），表明造模后大鼠比較緊張、驚擾不安。Morris水迷宮實驗是測試空間學習和記憶的較好方法。模型組大鼠逃避潛伏期延長、穿臺次數(shù)減少（P＜0.05），反映肝郁失眠大鼠學習記憶能力受損，這與臨床長期失眠患者自述記憶力減退相一致。

本研究結(jié)果顯示：松郁安神方可改善肝郁失眠大鼠在新環(huán)境中的自主行為、探究行為，減少焦慮，降低緊張度，穩(wěn)定情緒且改善學習記憶能力。肝郁失眠大鼠海馬5-HT1AR、CREB基因表達降低，這與文獻研究報道一致［13］。松郁安神方干預后，海馬5-HT1AR和CREB的基因及蛋白表達升高，與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示松郁安神方減輕焦慮、穩(wěn)定情緒、改善記憶可能是通過5-HT1A受體調(diào)節(jié)CREB信號通路起效。

綜上所述，松郁安神方能夠明顯改善肝郁失眠模型大鼠行為學，穩(wěn)定情緒，其作用機制與提高大鼠海馬組織中5-HT1A、CREB含量有一定關(guān)系，對于肝郁失眠的患者，用松郁安神方治療具有可行性。