HPLC一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定玳玳果黃酮降脂提取物4個(gè)效應(yīng)組分含量

馬國(guó)萍，陳 丹，朱仙慕，劉秀棉，洪麗婷，陳 思

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

一測(cè)多評(píng)法［1］（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）是指利用中藥有效成分的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，在只測(cè)定一個(gè)成分的情況下，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)定，本法對(duì)于解決中藥對(duì)照品制備困難或價(jià)格昂貴的狀況具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。玳玳（Citrus aurantium L.var daidai Tanaka）屬蕓香科柑桔亞屬植物，為酸橙變種，藥食同源中藥［2］，在我國(guó)福建、四川、浙江等地都有栽培。課題組前期研究表明：由玳玳果分離制備的玳玳果黃酮提取物具有良好的降脂抗氧化作用，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷等為其主要效應(yīng)組分，其中柚皮苷、新橙皮苷成分占總黃酮含量的60%以上［3-6］，但橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷對(duì)照品較難獲得。為有效控制玳玳果黃酮降脂提取物質(zhì)量，利用HPLC一測(cè)多評(píng)法（QAMS）建立同步測(cè)定玳玳果黃酮降脂提取物4個(gè)主要效應(yīng)組分柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷含量，并與HPLC外標(biāo)法（ESM）結(jié)果比較，以期建立運(yùn)用單一對(duì)照品，多指標(biāo)組分群控制玳玳果黃酮降脂提取物質(zhì)量，為玳玳果黃酮降脂提取物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2996 PDA檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；XS205十萬(wàn)分之一電子天平、AR2140萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ3200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 柚皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度＞98%，批號(hào)：110722-201111）；新橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度＞98%，批號(hào)：111857-201001）；橙皮內(nèi)酯水合物（實(shí)驗(yàn)室自制，純度為98.9%）；枳屬苷（實(shí)驗(yàn)室自制，純度為98.7%）；玳玳果黃酮提取物（自制，總黃酮含量在803.7～887.9 mg／g），批號(hào)分別為 20181015（批 1）、20181114（批 2）、20181201（批 3））；乙腈為色譜純；水為超純水：其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷對(duì)照品適量，分別加甲醇溶解，制得質(zhì)量濃度為0.597 mg／mL的新橙皮苷對(duì)照品溶液、質(zhì)量濃度為0.518 mg／mL的柚皮苷對(duì)照品溶液、質(zhì)量濃度為0.275 mg／mL的橙皮內(nèi)酯水合物對(duì)照品溶液、質(zhì)量濃度為0.328 mg／mL的枳屬苷對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制 精密稱(chēng)取玳玳果黃酮降脂提取物約10.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性對(duì)照品溶液的配制 取缺玳玳果黃酮降脂提取物的溶劑，按“2.2”項(xiàng)下同法操作，即得。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱Lichrocart C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A 為乙腈，B為0.2%冰醋酸水溶液，梯度洗脫［0～10 min AB（22∶78）；10～20 min A-B（35∶65）；20～25 min A-B（48∶52）；25～30 min A-B（22∶78）］；流速 1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng) 284 nm；柱溫 30℃；進(jìn)樣量 10 μL。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物及枳屬苷的色譜峰分離度均R＞1.5，理論塔板數(shù)按柚皮苷計(jì)大于3 000。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品、陰性對(duì)照和供試品的HPLC色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備及線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取不同體積的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷對(duì)照品貯備溶液，制成不同濃度的系列混合對(duì)照品溶液。精密吸取系列混合對(duì)照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，最小二乘法線(xiàn)性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：柚皮苷濃度在31.377～159.188 μg／mL 范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為 Y＝1.656×107X-2.620×104（r＝0.999 5）；新橙皮苷濃度在63.632～208.123 μg／mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝1.899×107X-1.841×104（r＝0.999 8）；橙皮內(nèi)酯水合物濃度在 3.899～12.241 μg／mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝9.090×106X-1.578×103（r＝0.999 6）；枳屬苷濃度在 2.696～17.366 μg／mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為 Y＝1.490×107X-8.179×103（r＝0.999 4）。

2.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液各 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，按“2.4”項(xiàng)下同法操作，測(cè)得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物及枳屬苷峰面積 RSD分別為 0.34%、0.48%、0.92%、1.09%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批玳玳果黃酮降脂提取物（批號(hào)：20181114），分別精密稱(chēng)取 6 份，按“2.2”和“2.4”項(xiàng)下同法操作，測(cè)得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物及枳屬苷的平均含量分別為288.50、368.70、26.04、15.05 mg／g，RSD 值 分 別 為 2.47% 、2.27%、2.40%、2.48%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取 10 μL 注入高效液相色譜儀，按“2.4”項(xiàng)下同法操作，記錄柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物及枳屬苷的峰面積值，計(jì)算得峰面積的 RSD值分別為 0.85%、0.42%、1.95%、1.29%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取干燥至恒重的玳玳果黃酮降脂提取物，分別精密稱(chēng)取約5 mg（批號(hào)：2018 1114），共6份，精密加入適量對(duì)照品溶液（每1 mL含柚皮苷0.520 mg、新橙皮苷 1.501 mg、橙皮內(nèi)酯水合物 0.275 mg、枳屬苷 0.328 mg），按“2.2”“2.4”項(xiàng)下同法操作、測(cè)定，計(jì)算得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷的平均回收率分別為97.99%、101.50%、98.21%、95.56%，RSD 分別為 2.07%、2.80%、2.92%、2.32%，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.10 內(nèi)參物的選擇及相對(duì)校正因子的計(jì)算 精密吸取含4組分系列混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，按“2.2”和“2.4”項(xiàng)下同法操作、測(cè)定，分別以新橙皮苷、柚皮苷（k）為內(nèi)參物，峰面積數(shù)據(jù)代入公式（1）分別計(jì)算內(nèi)參物與其他3個(gè)組分的相對(duì)校正因子（fkm）和RSD值，比較確定內(nèi)參物。

式中fk為內(nèi)參（柚皮苷或新橙皮苷）的相對(duì)校正因子，fm為其他3個(gè)待測(cè)組分如新橙皮苷或橙皮內(nèi)酯水合物或枳屬苷的相對(duì)校正因子，Wm為待測(cè)組分的量，Am為待測(cè)組分的峰面積值，Wk為內(nèi)參的量，Ak為內(nèi)參的峰面積值。

2.1 0.1 以新橙皮苷為內(nèi)參物 通過(guò)HPLC外標(biāo)法測(cè)定一系列不同濃度的對(duì)照品溶液及對(duì)應(yīng)的峰面積，按“2.10”項(xiàng)下公式（1），計(jì)算各成分與內(nèi)參物新橙皮苷的相對(duì)校正因子，計(jì)算出相應(yīng)的平均值，并計(jì)算RSD。見(jiàn)表1。

2.1 0.2 以柚皮苷為內(nèi)參物 通過(guò)HPLC外標(biāo)法測(cè)定一系列不同濃度的對(duì)照品溶液及對(duì)應(yīng)的峰面積，以柚皮苷為內(nèi)參物，按“2.10”項(xiàng)下公式（1），計(jì)算各成分與內(nèi)參物柚皮苷的相對(duì)校正因子，計(jì)算出相應(yīng)的平均值，并計(jì)算RSD。見(jiàn)表2。

2.11 樣品含量測(cè)定 分別取三批玳玳果黃酮降脂提取物，按“2.2”和“2.4”項(xiàng)下同法操作、測(cè)定。 采用ESM、QAMS分別測(cè)定玳玳果黃酮降脂提取物中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物及枳屬苷的含量。QAMS分別以新橙皮苷、柚皮苷為內(nèi)參物應(yīng)用公式（2），計(jì)算玳玳果黃酮提取物中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物及枳屬苷的含量。定量公式（2）由公式（1）導(dǎo)出。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

式中，Wm為待測(cè)組分的量，Am為待測(cè)組分的峰面積值，Wk為內(nèi)參的量，Ak為內(nèi)參的峰面積值，fkm為內(nèi)參k與待測(cè)組分m相對(duì)校正因子。

表1 以新橙皮苷為內(nèi)參物的fk／m測(cè)定結(jié)果

表2 以柚皮苷為內(nèi)參物的fk／m測(cè)定結(jié)果

表3 以新橙皮苷為內(nèi)參物的QAMS與ESM含量測(cè)定結(jié)果比較（n＝3，Q／RSD%）mg／g

表4 以柚皮苷為內(nèi)參物的QAMS與ESM含量測(cè)定結(jié)果比較（n＝3，Q／RSD%）mg／g

2.12 QAMS與ESM測(cè)定結(jié)果比較 取三批玳玳果黃酮降脂提取物，以QAMS計(jì)算4個(gè)效應(yīng)組分含量，與采用ESM測(cè)得的各效應(yīng)組分含量比較，考察QAMS的準(zhǔn)確度。結(jié)果表明：以新橙皮苷為內(nèi)參物時(shí)，QAMS與ESM的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05），同樣，以柚皮苷為內(nèi)參物時(shí)，兩種方法的測(cè)定結(jié)果也無(wú)顯著性差異（P＞0.05），提示建立的 QAMS計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于玳玳果黃酮降脂提取物4個(gè)效應(yīng)組分含量測(cè)定。同時(shí)，考慮到柚皮苷對(duì)照品較新橙皮苷對(duì)照品更為經(jīng)濟(jì)，故確定選擇以柚皮苷為內(nèi)參物的QAMS，建立同步測(cè)定玳玳果黃酮降脂提取物4個(gè)主要效應(yīng)組分含量測(cè)定。見(jiàn)表3、表4。

2.13 QAMS法與ESM測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析評(píng)價(jià)采用SPSS 18.0軟件的相關(guān)系數(shù)法，分別對(duì)三批玳玳果黃酮降脂提取物的4個(gè)效應(yīng)組分平均含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，利用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)結(jié)果。比較兩種方法測(cè)得結(jié)果的相關(guān)性，并計(jì)算相對(duì)誤差，判別QAMS用于玳玳果黃酮降脂提取物中4個(gè)效應(yīng)組分同步含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性與差異性。結(jié)果表明：采用QAMS同時(shí)測(cè)定玳玳果黃酮降脂提取物中4個(gè)效應(yīng)組分含量與ESM分別測(cè)定的含量結(jié)果呈正向直線(xiàn)相關(guān)（P＜0.05），QAMS和ESM測(cè)定的4個(gè)效應(yīng)組分含量結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05），因此以柚皮苷或新橙皮苷為內(nèi)參物的QAMS用于玳玳果黃酮降脂提取物多指標(biāo)成分群的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)是可行的。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)曾比較乙腈-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.2%冰醋酸水溶液的等度洗脫與梯度洗脫程序。結(jié)果表明：以乙腈-0.2%冰醋酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，供試品中各組分均達(dá)基線(xiàn)分離且峰型良好，各組分的保留時(shí)間、峰面積的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

比較不同柱溫（20、25、30、35 ℃）對(duì)色譜峰分離的影響，結(jié)果表明：在柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL條件下，基線(xiàn)平穩(wěn)，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷色譜峰峰形完整且穩(wěn)定，各色譜峰達(dá)到完全分離。另外，曾考察不同品牌色譜柱、不同高效液相色譜儀對(duì)色譜峰定位及色譜響應(yīng)因子（CRF）值穩(wěn)定性影響，結(jié)果表明：在不同高效液相色譜儀上使用 Lichrocart C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分析測(cè)定時(shí)，各組分的峰型均良好且CRF值穩(wěn)定，故選擇采用該色譜柱建立玳玳果黃酮降脂提取物的同步測(cè)定4個(gè)效應(yīng)組分的HPLC一測(cè)多評(píng)法。

課題組前期研究表明：玳玳果黃酮降脂提取物的主要效應(yīng)組分為柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷等，采用常規(guī)的外標(biāo)法建立玳玳果黃酮降脂提取物的含量測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定4個(gè)效應(yīng)組分含量，需要4個(gè)對(duì)照品，因橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷對(duì)照品缺乏且價(jià)格昂貴，所以實(shí)驗(yàn)分別選取對(duì)照品簡(jiǎn)便易得且含量較高的新橙皮苷、柚皮苷作為內(nèi)參物，計(jì)算4個(gè)效應(yīng)組分含量。與采用ESM測(cè)得的各效應(yīng)組分含量比較，兩種方法的測(cè)定結(jié)果間均無(wú)顯著性差異。在此基礎(chǔ)上，綜合考慮因柚皮苷對(duì)照品較新橙皮苷對(duì)照品更為經(jīng)濟(jì)，故選擇柚皮苷為內(nèi)參物，建立同步測(cè)定玳玳果黃酮降脂提取物4個(gè)主要效應(yīng)組分的QAMS，使適合中藥玳玳果降脂提取物多組分、多層次、多靶點(diǎn)的特性，達(dá)到多指標(biāo)質(zhì)量控制的目的。

實(shí)驗(yàn)利用玳玳果黃酮降脂提取物主要效應(yīng)組分間的相互關(guān)系，建立QAMS同步測(cè)定提取物4個(gè)效應(yīng)組分含量，判別QAMS用于玳玳果黃酮降脂提取物中4個(gè)效應(yīng)組分同步含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性與差異性。結(jié)果表明：采用ESM與QAMS法測(cè)定的含量結(jié)果呈正向直線(xiàn)相關(guān)，計(jì)算的含量結(jié)果之間沒(méi)有顯著性差異，驗(yàn)證了QAMS的準(zhǔn)確性。研究建立的QAMS準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)便可行，可用于玳玳果黃酮降脂提取物的多指標(biāo)質(zhì)量的定量監(jiān)控。