鼠疫的發(fā)病機制研究進展

張怡, 張昊澄

復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科， 上海 200040

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌感染引起的一種人畜共患病(鼠間鼠疫和人間鼠疫)，也是我國法定傳染病中的甲類傳染病。鼠間鼠疫主要在嚙齒類動物間流行，鼠、旱獺等為鼠疫耶爾森菌的自然宿主，鼠蚤是傳播媒介。根據臨床特征，人間鼠疫分為腺型、肺型和敗血癥型，主要癥狀為高熱、畏寒、淋巴結腫大、皮膚黏膜出血、呼吸急促等。傳播途徑包括鼠蚤叮咬傳播、呼吸道傳播和接觸傳播[1]。在世界范圍內鼠疫出現過3次大流行。目前我國的鼠疫防治形勢依舊嚴峻，主要原因是疫源地面積不斷擴大、人口流動愈加頻繁等。今年，我國已確診2例肺鼠疫和1例腺鼠疫病例。

引起鼠疫的病原體為鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis，Y.pestis)，又稱鼠疫桿菌，屬腸桿菌科的耶爾森菌屬，為革蘭陰性桿菌。鼠蚤叮咬是鼠疫最主要的傳播途徑，為“鼠疫耶爾森菌-鼠蚤-宿主”的傳播模式。鼠疫耶爾森菌定居在鼠蚤腸中，不斷繁殖后可造成約50%的鼠蚤發(fā)生腸道梗阻[2-3]，患腸梗阻的鼠蚤在叮咬哺乳動物時又將細菌注入正常宿主[4-5]。當哺乳動物宿主血液中鼠疫耶爾森菌的含菌量>1×108/mL時，鼠蚤叮咬后也可被感染，并在幾日或幾周后發(fā)生腸梗阻，然后死亡[6]。

分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，鼠疫耶爾森菌是從假結核耶爾森菌進化而來[7]。鼠疫耶爾森菌和假結核耶爾森菌有許多共同的毒力機制，如由70 kb左右的質粒(鼠疫耶爾森菌中的pCD1和假結核耶爾森菌中的pYV)編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)及鐵攝取。與假結核耶爾森菌相比，鼠疫耶爾森菌還具有其獨特的傳播途徑和毒力機制，是鼠蚤傳播的高毒力病原體，對人類具有高致病性。

鼠疫耶爾森菌的發(fā)病機制與其獨特的毒力因子及與哺乳動物宿主的相互作用密切相關。毒力因子在昆蟲和哺乳動物內有所不同。與哺乳動物的相互作用包括對宿主細胞的黏附和侵襲、細胞內繁殖及與免疫細胞的相互作用。

1 在昆蟲體內的毒力因子

1.1 磷脂酶D

磷脂酶D被鑒定為鼠疫耶爾森菌毒素，由pFra質粒上的ymt基因編碼[3],可幫助鼠疫耶爾森菌在鼠蚤腸中定居和繁殖, 抵抗鼠蚤腸中活躍的各種抗菌因子有助于增強其在鼠蚤腸道中的生存率[3]。

1.2 生物膜的形成

鼠疫耶爾森菌需要形成生物膜來阻斷鼠蚤的前角質，這是鼠疫通過鼠蚤傳播的關鍵[8-9]。耶爾森菌中生物膜的形成受第二信使環(huán)雙鳥苷酸(c-di-GMP)正調控[10]，且受雙組分Rcs調控系統(tǒng)負調控。 Rcs由膜蛋白RcsD和RcsC、DNA結合調節(jié)劑RcsB及輔助蛋白RcsA組成。RcsB/RcsA抑制雙鳥苷酸環(huán)化酶HmsT的表達[11]，抑制生物膜產生。rcsA基因突變是假結核耶爾森菌演變成經鼠蚤傳播鼠疫耶爾森菌的必需條件。在鼠疫耶爾森菌中，rcsA被滅活，導致生物膜形成[12-13]。

2 在哺乳動物宿主體內的毒力因子

2.1 T3SS

T3SS作為鼠疫耶爾森菌致病的重要毒力因素，在耶爾森菌毒力質粒pYV/pCD1中編碼，是一種在致病性革蘭陰性細菌中高度保守的轉運裝置[14]。耶爾森菌外膜蛋白(Yersinia outer protein,Yop)構成了一系列通過T3SS直接轉移到宿主細胞中的效應分子[15-17]。T3SS負責將Yop轉位到宿主細胞中。一旦進入宿主細胞，Yop就會破壞信號級聯，在感染過程中發(fā)揮多效性作用：①抑制Rho GTPases，并破壞肌動蛋白細胞骨架以抑制宿主免疫細胞的吞噬作用；②下調促炎性細胞因子產生；③通過多種復雜機制誘導細胞死亡[18]。目前，已經確定的Yop效應分子有6個(YopH、YopE、YopJ/P、YpkA/YopO、YopT和YopM)[19]。

Yop效應分子的遞送以及對細胞侵襲需要鼠疫耶爾森菌黏附至宿主細胞。染色體編碼的Ail外膜蛋白有助于細胞附著和Yop傳遞[20]。Psa菌毛(pH 6抗原)是促進Yop分泌的另一個因素，它通過抑制巨噬細胞的吞噬作用及糖鞘磷脂與磷脂酰膽堿的相互作用，介導耶爾森菌與上皮細胞的結合[21]。

LcrV (low-calcium response V antigen，LcrV)是T3SS系統(tǒng)的針帽蛋白，可誘導白細胞介素10(IL-10)產生并抑制促炎性細胞因子生成。LcrV與人免疫細胞上的甲酰基肽受體1 (formyl peptide receptor 1，FPR1)結合，從而促進細菌效應分子的轉運。缺乏FPR1的小鼠存活率顯著增加，其抗鼠疫的抗體反應也隨之增高。Charlton及其團隊發(fā)現，FPR1R190W是保護中性粒細胞免受鼠疫耶爾森菌T3SS破壞的候選等位基因。FPR1是人類和小鼠免疫細胞中的共同受體，其突變或缺失可幫助小鼠和人類抵抗鼠疫耶爾森的侵襲[22]。

2.2 Pla

Pla是一種纖溶酶原激活劑，由鼠疫耶爾森菌獨有的質粒pPCP1編碼[23]。 獲得pPCP1是鼠疫耶爾森菌從其祖先假結核耶爾森菌進化而來的關鍵[24]。Pla的主要活性是將纖溶酶原裂解為纖溶酶，進一步降解纖維蛋白凝塊、層黏連蛋白和纖連蛋白等細胞外基質蛋白，從而促進細菌傳播[25]。

Pla對一系列底物的蛋白酶活性使細菌在鄰近的淋巴組織[26]和遠端內臟(包括肝臟和脾臟)定殖，促進鼠疫耶爾森菌從皮下感染部位傳播[27]，被證明在原發(fā)性肺鼠疫中起作用[27]。

2.3 F1膠囊蛋白(F1a)

F1a是由鼠疫耶爾森菌特有的pMT1質粒編碼，是其主要毒力因子之一。F1a在35～37 ℃下生長加速，可以覆蓋細菌表面。在感染過程中，鼠疫耶爾森菌從巨噬細胞中被釋放，并表達大量F1a[28]。盡管F1a陰性菌株顯示與野生型相似的毒力，但F1a與其他抗吞噬因子一起有效地抑制了宿主細胞對鼠疫耶爾森菌的吞噬作用，并在體內促進了鼠疫耶爾森菌的細胞外存活。最近研究提供了F1a抑制上皮細胞吞噬作用的直接證據[29]。

2.4 鐵攝取

哺乳動物宿主中存活的鼠疫耶爾森菌需具有從哺乳動物鐵結合蛋白中獲取鐵的能力。耶爾森菌素(yersiniabactin, Ybt)鐵載體所依賴的鐵轉運系統(tǒng)至關重要。鐵轉運系統(tǒng)位于不穩(wěn)定的102 kb DNA片段上，即色素沉著pigmentation (pgm)位點，由致病性耶爾森菌共有的高致病性基因島編碼。編碼鐵載體Ybt依賴的鐵轉運系統(tǒng)ybt基因座包括用于Ybt鐵載體合成的基因簇﹝高分子量蛋白1(HMWP1)、HMWP2 (YbtD、YbtE、YbtS、YbtT、YbtU)和Ybt攝取(YbtQ 、YbtP、Psn)﹞[30]。

3 對宿主細胞的黏附和侵襲

鼠疫耶爾森菌喜歡侵襲特殊類型的細胞，如肺巨噬細胞和肺泡上皮細胞。肺炎球菌表面黏附素A (pneumococcal surfaceadhesin A, PsaA)僅在特定pH值(pH 5.0～6.0)和哺乳動物體溫(37 ℃)環(huán)境中表達[31]。巨噬細胞中吞噬酶的酸化誘導耶爾森菌合成PsaA[32]。PsaA通過介導宿主細胞和細菌之間的相互作用來促進經T3SS的Yop傳遞[33]。采用具有psaA突變的減毒株靜脈感染小鼠后，半數致死量(LD50)升高將近100倍[34-35]。

Ail (attachment invasion locus，Ail)是一種染色體編碼的小膜蛋白，屬于腸桿菌Ail/Lom外膜蛋白家族，是鼠疫耶爾森菌的主要黏附素。鼠疫耶爾森菌KIM5株的Ail突變后(pgm-)，與細胞的結合能力降低，通過靜脈感染的小鼠減毒至原來的1‰以下。在鼻內滴入Ail缺失的強毒性CO92株細菌，可延遲小鼠的死亡時間，并且該突變在大鼠肺鼠疫模型中減毒約至原來的1/10萬[36-37]。Ail在 26 ℃ 和37 ℃均呈高水平表達，可與細胞外基質的纖連蛋白、層黏連蛋白和肝素[38-40]結合，幫助其及Yop進入宿主細胞。

Ail與包括補體抑制劑C4b結合蛋白和體外nectin(一種參與細胞附著、纖溶和抑制補體系統(tǒng)的宿主蛋白)在內的相關底物結合，促進黏附和侵襲的發(fā)生[41-42]。

4 細胞內繁殖

在細胞內繁殖的初始階段，鼠疫耶爾森菌適應哺乳動物宿主內環(huán)境十分重要。在典型的自然傳播中，被感染的鼠蚤在攝入哺乳動物血液的同時，通過嘔吐的方式將鼠疫耶爾森菌注入宿主皮下組織，而宿主的巨噬細胞則將位于皮下組織內的耶爾森菌攝入。該過程為鼠疫耶爾森菌創(chuàng)造了獨特的細胞內生態(tài)位，為其后續(xù)成功進行胞內繁殖并逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊提供了有效條件[43]。此后，鼠疫耶爾森菌通過多種毒力因子(如前描述)，迅速適應哺乳動物宿主內環(huán)境，避免被吞噬并開始啟動其細胞外周期[44]。它可在體內或體外感染初始階段的巨噬細胞內存活并完成繁殖[45]，但會被中性粒細胞和活化的巨噬細胞有效殺滅[43, 46]。專職巨噬細胞吞噬并消化細菌，抗原呈遞細胞可將細菌中的肽呈遞到細胞表面，刺激宿主防御信號，從而清除入侵細菌。通過巨噬細胞液泡酸化，含有截留細菌的吞噬體與溶酶體融合，逐漸成熟為吞噬溶酶體。值得一提的是，鼠疫耶爾森菌會抑制吞噬體的酸化及自噬，從而使未成熟的吞噬體成為保護細菌和促進胞內繁殖的重要屏障[45]。

許多研究揭示了在宿主巨噬細胞中耶爾森菌的存活過程。Lukaszewski等研究表明，在感染后5 d (dpi, days postinfection)才能在脾臟巨噬細胞中持續(xù)檢測到鼠疫耶爾森菌，然而在小鼠-豚鼠鼠疫模型中，感染后72小時(hpi, hours postinfection)即可在脾中性粒細胞中檢測到鼠疫耶爾森菌[43]。體外培養(yǎng)時，脾中性粒細胞中的鼠疫耶爾森菌不能存活，但脾巨噬細胞中的鼠疫耶爾森菌卻可被培養(yǎng)，表明中性粒細胞抑制了鼠疫耶爾森菌的生長，而巨噬細胞則無法抑制其生長。Spinner等研究結果表明，胞內鼠疫耶爾森菌可在人培養(yǎng)多形核白細胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)中存活并繁殖，且大部分鼠疫耶爾森菌感染的PMN在12 hpi會發(fā)生細胞凋亡。但這些PMN可進一步被巨噬細胞識別，被胞吞后的鼠疫耶爾森菌可繼續(xù)完成存活、繁殖周期[47]。感染早期階段，動物的組織病理學證據表明鼠疫耶爾森菌繁殖后可在細胞外存活[43,48]。巨噬細胞為鼠疫耶爾森菌的繁殖提供了重要的庇護場所。

Pujol等研究結果表明，鼠疫耶爾森菌能在被γ干擾素激活的巨噬細胞中繁殖，需要pgm位點內RipA(由ripA，ripB和ripC組成)的參與[46]。RipA為產生丁酸酯的丁酰輔酶A(CoA)轉移酶，丁酸酯可降低巨噬細胞產生一氧化氮(nitric oxide，NO)的水平[49]。低水平的NO為鼠疫耶爾森菌在巨噬細胞內的繁殖提供了條件[50]。PhoP/PhoQ系統(tǒng)是耶爾森菌繁殖的重要分子，其中 PhoQ是傳感器，PhoP是效應器。在既往傷寒沙門菌的研究中，PhoP已被證實參與了巨噬細胞內的細菌存活和繁殖。Oyston等體外實驗表明，PhoP/PhoQ對于巨噬細胞系J774A.1細胞中的耶爾森菌存活非常重要。在低pH值合并氧化應激條件下，phoP突變的LD50增加了75倍[51]。在果蠅的消化道中，鼠疫耶爾森菌誘導PhoP/PhoQ可調節(jié)細菌對環(huán)境壓力的適應力，從而促進細菌外表面的修飾和生物膜的形成[52]。

5 與宿主免疫防御的相互作用

鼠疫耶爾森菌具有多種抗炎機制，輔助其在感染初期迅速繁殖且不被宿主殺滅。鼠疫耶爾森菌的LcrV通過與TLR2的相互作用誘導產生抗炎因子IL-10[53]；通過T3SS系統(tǒng)注入Yop毒力因子而影響免疫細胞，即YopE、YopT和YpkA破壞細胞骨架，YopH、YopE、YopT和YpkA抑制吞噬作用，YopJ下調炎癥反應[54]。

鼠疫耶爾森菌能迅速抑制哺乳動物宿主的天然免疫反應，促進其快速繁殖[55-57]。鼠疫耶爾森菌在鼠蚤叮咬附近的淋巴結中迅速繁殖，在感染早期(6～36 hpi)，機體因無法識別進而無法產生炎癥反應，細菌從腹股溝淋巴結內逸出并迅速擴散入血，從而定居于肝、脾、肺。在感染的后階段，宿主的免疫反應主要表現為炎癥細胞浸潤、細胞因子產生和組織壞死。用原發(fā)性肺鼠疫的小鼠鼻內滴定模型進行病理學研究，證實了上述機制，在感染初期的 24～36 hpi無顯著炎癥表現， 48 hpi炎癥顯著活化，3 dpi顯示死亡狀態(tài)[48]。另一項研究顯示， 48 hpi才觀察到中性粒細胞向肺部聚集，且在此階段無法檢測到支氣管肺泡灌洗液中的前纖毛化趨化因子[58]。已報道的感染鼠疫耶爾森菌的動物或培養(yǎng)細胞基因轉錄組分析均顯示，鼠疫耶爾森菌在不同感染模型中的各個階段均可抑制天然免疫應答[56, 59-62]。由此產生的全身性炎癥反應綜合征可能導致彌散性血管內凝血、出血、器官衰竭和休克，四肢和軀干出現紫癜，壞疽可發(fā)生在手指、腳趾、耳朵和鼻子尖端[63]。

鼠疫雖然是較為古老的傳染病[64]，但是在世界范圍內的3次大流行對人類造成了無法磨滅的傷害。目前因疫源地面積不斷擴大和人口流動的原因，仍存在鼠疫再次大流行的風險。需要對鼠疫進行預防和控制，以便對于暴露后的人群進行及時處理和診治[65-66]。本文對其發(fā)病機制進行研究，旨在為防治鼠疫提供理論知識基礎，同時也為其他病原菌的研究提供較為清晰、完善的模板。