結(jié)腸直腸癌早期診斷中DNA甲基化檢測(cè)的研究進(jìn)展

胡育銘， 鄭 闊 綜述 于冠宇， 張 衛(wèi) 審校

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院肛腸外科，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433）

結(jié)腸直腸癌（colorectal cancer,CRC）是最常見的胃腸道惡性腫瘤。每年全世界新發(fā)CRC150萬例[1-2]，在惡性腫瘤發(fā)生率位于第3位。每年死于CRC例數(shù)約60萬，在癌癥死因中占第3位[2]。在全球范圍內(nèi)，CRC的發(fā)病率和病死率仍進(jìn)一步升高。CRC起病隱匿，進(jìn)展較快，病人預(yù)后與明確診斷時(shí)的臨床分期密切相關(guān)。2015年我國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：我國CRC發(fā)病率、死亡率在全部惡性腫瘤中均居第5位。其中新發(fā)病例37.6萬，死亡病例19.1萬。城市地區(qū)遠(yuǎn)高于農(nóng)村，且結(jié)腸癌的發(fā)病率上升顯著。多數(shù)病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于中、晚期[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，Ⅰ期CRC病人的5年生存率高于90%，而Ⅳ期CRC病人低于10%[4]。因此CRC的早期診斷對(duì)于降低CRC的病死率意義重大。

CRC現(xiàn)有篩選手段及特點(diǎn)

一、全結(jié)腸鏡/乙狀結(jié)腸鏡檢查

全結(jié)腸鏡/乙狀結(jié)腸鏡（腸鏡）檢查因其高度的靈敏度和特異度已成為普通人群中CRC早期診斷的主要手段[5-6]，但腸鏡的推廣仍受一些因素的制約。一方面，腸鏡作為一種侵入性的檢查手段，在檢查過程中會(huì)引發(fā)較大的不適感，且可能造成出血、穿孔等并發(fā)癥發(fā)生[6]，限制病人對(duì)于腸鏡的接受程度。另一方面，腸鏡因其花費(fèi)的醫(yī)療資源相對(duì)較多，不適合作為CRC大規(guī)模早期篩查的方式。

二、大便隱血實(shí)驗(yàn)

大便隱血試驗(yàn)（fecal occult blood test,FOBT）也是CRC常見的篩查手段[7]。FOBT優(yōu)勢(shì)在于相較于腸鏡檢查，其極易完成，幾乎無任何風(fēng)險(xiǎn)，所占用的醫(yī)療資源較少。但FOBT的不足也很明顯，飲食、結(jié)腸炎，痔瘡以及溫度均能嚴(yán)重影響其特異性[8]。因此，F(xiàn)OBT不能作為單獨(dú)篩選檢查手段。檢查陽性結(jié)果的病人仍需行結(jié)腸鏡檢查[9]。

三、血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)

目前用于臨床檢測(cè)的血清腫瘤標(biāo)志物 （tumor marker,TM）主要為表型標(biāo)志物，包括CEA、CA19-9等。 但目前臨床上用于檢測(cè)的TM特異度和靈敏度仍待進(jìn)一步提高。如CEA升高不僅見于腫瘤，在結(jié)腸息肉、肝硬化、慢性肝炎、心血管疾病以及糖尿病病人也會(huì)升高[10]。因此，臨床上此類腫瘤標(biāo)志物常用于術(shù)后CRC的復(fù)發(fā)檢測(cè)指標(biāo)。

近年來，游離DNA在CRC早期診斷中作用的研究逐步開展，有望成為一種新型的血清腫瘤標(biāo)志物。游離DNA是一種主要存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中的胞外DNA，普遍認(rèn)為主要來源于凋亡壞死的細(xì)胞。研究表明，在乳腺癌、肺癌、食管癌等多種腫瘤病人體內(nèi)，游離DNA的濃度以及完整性與正常人群存在顯著差異，并對(duì)預(yù)后判斷有很大的參考價(jià)值[11-12]。在早期診斷CRC的傳統(tǒng)方式存在許多不足的背景下，游離DNA可能成為鑒定微小殘留疾病、評(píng)估治療反應(yīng)和預(yù)后以及鑒定耐藥機(jī)制有希望的方式之一[13]?？稍诓∪说难汉图S便中找到CRC細(xì)胞來源的異常甲基化DNA，且有證據(jù)表明血液DNA甲基化可反映腫瘤組織的甲基化程度[14]。但是，由于血清中cfDNA（cell free DNA）的含量很低，其完整性又受到很多因素的影響。因此，游離DNA的檢測(cè)內(nèi)容仍有待完善，其中檢測(cè)游離DNA甲基化狀態(tài)有望成為CRC早期診斷的理想手段。

DNA甲基化及其作為CRC早期診斷標(biāo)志物的可行性分析

一、DNA甲基化

DNA甲基化是真核生物表觀遺傳修飾的重要方式之一，其可發(fā)生在染色體DNA和組蛋白上。DNA甲基化的部位包括啟動(dòng)子、基因本體等。目前研究認(rèn)為，啟動(dòng)子的DNA甲基化能抑制基因的表達(dá)，而基因本體的甲基化對(duì)基因本體的影響可能不大[15]。啟動(dòng)子的DNA甲基化主要發(fā)生在CpG序列的部位，即CpG島。當(dāng)CpG島上的胞嘧啶C發(fā)生甲基化后，其能通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)等機(jī)制抑制基因轉(zhuǎn)錄[16]，能穩(wěn)定存在于DNA復(fù)制期間，并遺傳給子代。

二、DNA異常甲基化參與CRC的發(fā)生和發(fā)展

CRC的發(fā)生是一個(gè)多階段多步驟的過程。目前公認(rèn)的大多數(shù)CRC發(fā)病模式為正常黏膜異常隱窩病灶（abnormal crypt foci,ACF）-腺瘤-惡性腫瘤。多種癌基因的突變和抑癌基因的失活是CRC發(fā)生的分子基礎(chǔ)[17-18]。這一過程由突變和表觀遺傳改變的積累驅(qū)動(dòng)，需10～15年才能發(fā)生。但在某些情況下可更快地發(fā)展，如Lynch綜合征病人。直到5～10年前，管狀和管狀絨毛狀腺瘤性息肉仍被認(rèn)為是唯一能進(jìn)展為癌癥的病變[19]。散發(fā)性CRC約占所有CRC總數(shù)的85%[20]，其發(fā)生、發(fā)展涉及的基因數(shù)目較多，提示其發(fā)生的必要條件可能是基因組不穩(wěn)定[21]。在CRC中，發(fā)現(xiàn)異常DNA甲基化涉及許多基因，如DNA錯(cuò)配修復(fù)基因 （mismatch repair,MMR）、WNT信號(hào)通路基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因。 具有廣泛甲基化CRC的子組被稱為CIMP+[22]。目前研究表明，兩種基因組的不穩(wěn)定途徑參與CRC的發(fā)生：微衛(wèi)星不穩(wěn)定途徑和染色體不穩(wěn)定途徑[23-24]，而兩種途徑都與DNA異常甲基化有關(guān)。

DNA異常甲基化導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性。染色體不穩(wěn)定性主要是指染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和倍體類型發(fā)生改變。研究表明，在CRC發(fā)生過程中，染色體不穩(wěn)定性是最常見的現(xiàn)象，并與細(xì)胞的異常增殖、侵襲有關(guān)[25]。染色體不穩(wěn)定的重要機(jī)制是一系列抑癌基因（GATA4、GATA5、p16等）的啟動(dòng)子片段甲基化異常升高，從而導(dǎo)致染色體丟失或增加[26-27]。

DNA異常甲基化與微衛(wèi)星不穩(wěn)定途徑。微衛(wèi)星不穩(wěn)定能反映胞內(nèi)MMR功能缺陷。在散發(fā)性CRC中，MMR基因（主要是 MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2）功能缺陷的重要機(jī)制并非本身突變，而是其啟動(dòng)子序列上CpG島發(fā)生過度甲基化，從而使基因轉(zhuǎn)錄受到限制而導(dǎo)致MMR蛋白無法表達(dá)[28-29]。

三、游離DNA中異常甲基化片段檢測(cè)的技術(shù)可行性

在CRC細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中，部分腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡壞死，釋放出DNA進(jìn)入循環(huán)。通過一定的技術(shù)手段對(duì)循環(huán)中游離DNA片段進(jìn)行檢測(cè)，有望發(fā)現(xiàn)異常甲基化片段，實(shí)現(xiàn)對(duì)CRC的早期診斷。

常規(guī)的甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）非常敏感，但結(jié)果卻呈現(xiàn)高假陽性和假陰性，且只能定性地來解釋結(jié)果。這些原因都限制其臨床應(yīng)用[30]。基于定量甲基化特異性PCR（熒光法、SMART-甲基化特異性PCR等）的方法提供更易選擇的甲基化閾值，且避免識(shí)別不完全重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化假陽性結(jié)果的機(jī)會(huì)。其他方法包括甲基化陣列、DNA陣列、表面增強(qiáng)拉曼反射和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性等[31]。另一個(gè)“數(shù)字化”的方法，被稱為“甲基化-Beaming”技術(shù)，被Li等[32]研究證明，可用來針對(duì)血液中少量的環(huán)狀DNA對(duì)癌癥衍生的波形蛋白DNA進(jìn)行數(shù)字量化。Leary等[33]研究針對(duì)以前的方法無法重復(fù)和靈敏度不高等缺陷提供理想的結(jié)果。使用高通量測(cè)序技術(shù)方法區(qū)分CRC病人晚期與健康人對(duì)照的研究取得了令人鼓舞的結(jié)果。高通量測(cè)序技術(shù)具有高靈敏度，并覆蓋CRC早期檢測(cè)基因組的大片區(qū)域。

循環(huán)DNA甲基化檢測(cè)在CRC早期檢測(cè)的相關(guān)研究

一、單基因檢測(cè)

SEPT9基因用于循環(huán)DNA甲基化檢測(cè)。SEPT9基因參與細(xì)胞增殖控制。在CRC中，SEPT9的V2啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化。Grützmann等[34]研究表明，在 CRC病人血漿中SEPT9基因檢出的靈敏度72%、特異度90%。最近，Church等[35]進(jìn)行一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)。研究納入7 941例無癥狀個(gè)體，分析篩查期間的SEPT9甲基化的情況。結(jié)果顯示，具有該基因甲基化的個(gè)體中，CRC檢出率高達(dá)48.2%，特異度高達(dá)91.5%。Fu等[36]研究顯示，手術(shù)后7～14 d血漿SEPT9甲基化的持續(xù)陽性與發(fā)生1年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，靈敏度100%。隨訪期間術(shù)后SEPT9甲基化狀態(tài)也為CRC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移提供有價(jià)值指標(biāo)，揭示其在評(píng)估CRC療效和監(jiān)測(cè)CRC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移中的重要作用。顯然，檢測(cè)SEPT9甲基化的方法需進(jìn)一步改進(jìn)，以提高其檢出率。

二、多基因聯(lián)合檢測(cè)

研究表明，對(duì)多個(gè)基因甲基化檢測(cè)的組合分析可使CRC的檢測(cè)率更高。根據(jù)Ladefoged等[37]研究，對(duì)193例CRC病人和102例結(jié)腸鏡檢查健康的對(duì)照進(jìn)行橫斷面病例對(duì)照研究顯示，單個(gè)高甲基化DNA啟動(dòng)子區(qū)域作為CRC篩選標(biāo)志物價(jià)值有限。然而，一組7個(gè)高甲基化啟動(dòng)子區(qū)域作為CRC檢測(cè)的模型顯示出廣闊的應(yīng)用前景[37]。Alhquist等[38]研究發(fā)現(xiàn)，與使用SEPT9（靈敏度60%）早期診斷檢測(cè)CRC相比，使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP3）、N-myc下游調(diào)節(jié)家族成員（NDRG4）波形蛋白、組織因子途徑抑制劑 2（TFPI2）、突變型KRAS和β-肌動(dòng)蛋白等甲基化基因的組合，靈敏度可達(dá)87%。Symonds等[39]用數(shù)字PCR測(cè)定來測(cè)量腫瘤組織DNA中 5個(gè)癌癥特異性甲基化基因座（EYA4、GRIA4、ITGA4、MAP3K14-AS1和MSC）的甲基化，檢測(cè)到至少一種標(biāo)志物中的甲基化（85.7%）。且得出這5種基因聯(lián)合甲基化監(jiān)測(cè)可用于避免病人特異性突變的缺失及不同治療方案中監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性CRC病人療效的結(jié)論。根據(jù)Carmona等[40]研究，當(dāng)聯(lián)合AGTR1、WNT2、SLIT2時(shí)，CRC的早期診斷靈敏度可達(dá)78%。此外，Cassinotti等[41]展示了一些基因組合的潛在應(yīng)用價(jià)值，包括D型細(xì)胞周期蛋白基因、腫瘤高甲基化-蛋白1（HIC1）PAX5、Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)家族 1、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因（RASSF1A）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤抑制因子和綿羊紅細(xì)胞，其診斷靈敏度達(dá)84%，特異性達(dá)68%。綜上所述，通過游離DNA中多基因異常甲基化的檢測(cè)，有望實(shí)現(xiàn)CRC早期診斷體系的建立。

挑戰(zhàn)與前景

一、循環(huán)DNA甲基化檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)

盡管循環(huán)DNA甲基化檢測(cè)在CRC早期診斷中已展現(xiàn)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但仍有許多因素限制其在臨床上廣泛應(yīng)用。其中，游離DNA含量較低，不易檢測(cè)一直以來都是難以解決的問題。盡管CRC病人體內(nèi)的游離DNA含量高于正常人，但在許多病理狀態(tài)下，如炎癥、創(chuàng)傷等，游離DNA的含量仍會(huì)明顯升高[42]。這就對(duì)游離DNA分離技術(shù)提出更高的要求。因此，也就可能增加游離DNA檢測(cè)的成本。此外，在對(duì)病人行游離DNA甲基化檢測(cè)的過程中，血液標(biāo)本的采集、保存和處理流程仍有待進(jìn)一步規(guī)范。研究表明，抽血和離心的間隔時(shí)間、樣本的儲(chǔ)存模式、使用的抗凝劑種類及溫度和血漿DNA的分離方案對(duì)于循環(huán)DNA分析的效率和質(zhì)量都具有一定影響[43]。

二、循環(huán)DNA甲基化檢測(cè)的應(yīng)用前景

在傳統(tǒng)的CRC早期診斷方式存在著諸多不足的背景下，通過檢測(cè)病人血液中游離DNA甲基化狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)疾病的診斷無疑是一種理想的檢測(cè)手段。盡管面臨諸多不足和挑戰(zhàn)，但不可否認(rèn)，循環(huán)DNA甲基化檢測(cè)用于CRC早期診斷在已有的研究中已展現(xiàn)很好的應(yīng)用前景。通過對(duì)檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)更新、多基因聯(lián)合檢測(cè)以及確立規(guī)范化的檢測(cè)流程，有望提高臨床推廣的可行性。