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    諾如病毒的致病機(jī)制及診斷

    2019-12-21 14:11:34周弘璐譚明汪萱怡
    微生物與感染 2019年5期
    關(guān)鍵詞:抗原腸道個體

    周弘璐,譚明,汪萱怡,4

    1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200032; 2. 辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心傳染病室,辛辛那提,俄亥俄州,美國; 3. 辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科系,辛辛那提,俄亥俄州,美國; 4. 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院,上海 201102

    感染性腹瀉為國際上公認(rèn)的5歲以下兒童第2位死因[1]。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和衛(wèi)生條件及飲水設(shè)施的改善,細(xì)菌和寄生蟲感染得以控制,感染性腹瀉的病原逐漸以病毒為主。由于輪狀病毒(rotavirus,RV)疫苗的推廣,諾如病毒(norovirus, NoV)已取代RV成為病毒性急性胃腸炎的第一病原體,并因此越來越引起全球的關(guān)注[2]。NoV是引起全人群急性胃腸炎(acute gastroenteritis, AGE)流行和暴發(fā)的主要病原體,也是引起食源性疾病的最常見非細(xì)菌性病原體[3]。NoV主要以糞-口途徑傳播,平均潛伏期為12~48 h,典型癥狀包括嘔吐(≥50%的病例)、腹瀉、惡心、腹部絞痛、肌肉痛、低熱等,持續(xù)2~3 d,具有良好的自限性。但在<5歲兒童、>60歲老年人以及免疫功能缺陷患者中可引起嚴(yán)重的疾病,導(dǎo)致脫水、休克甚至死亡[4]。

    1 NoV的病毒學(xué)特性

    NoV屬于杯狀病毒科NoV屬,為單股正鏈的小RNA病毒,無包膜,直徑為27~40 nm,呈二十面體對稱球形?;蚪M全長約7.7 kb,包含3個開放讀碼框(open reading frame, ORF)ORF1、ORF2和ORF3[5]。ORF1編碼1個多聚蛋白,翻譯后裂解成為6種非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structure protein,NS),在病毒復(fù)制中起重要作用。ORF2和ORF3分別編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白(major structural protein,VP1)和次要結(jié)構(gòu)蛋白(minor structural protein,VP2)。X線晶體結(jié)構(gòu)分析顯示,衣殼蛋白VP1包含兩大結(jié)構(gòu)域,分別是殼區(qū)(shell 或 S domain)和突起結(jié)構(gòu)域(protruding 或 P domain),后者可進(jìn)一步分為提高病毒穩(wěn)定性的P1亞結(jié)構(gòu)域和高度可變的P2亞結(jié)構(gòu)域,P區(qū)和S區(qū)通過柔性的鉸鏈區(qū)連接,高變的P2區(qū)決定病毒的抗原性,但位于P2區(qū)的受體結(jié)合部位相對保守,與宿主受體結(jié)合,啟動感染。成熟的病毒顆粒包含180個VP1蛋白,組成90個二聚體,形成二十面體對稱結(jié)構(gòu)。早期依賴電鏡方法對病毒進(jìn)行描述區(qū)分,NoV在電鏡下顯示杯狀結(jié)構(gòu)(cup-like structure),故稱杯狀病毒。最近研究表明,NoV和宿主受體結(jié)合后,杯狀病毒的次要衣殼蛋白VP2形成一穿透衣殼的特殊通道,幫助NoV釋放基因組RNA到宿主細(xì)胞[6]。

    NoV宿主廣泛,可感染人類、嚙齒動物、貓科動物、犬科動物、海獅、豬、綿羊、牛、蝙蝠等。NoV具有高度的基因多態(tài)性,根據(jù)VP1蛋白序列及其編碼的序列不同,可將其分為7個基因組(GⅠ~Ⅶ),其中GⅠ、GⅡ和GⅣ能感染人類并致病,所以又稱人源諾如病毒 (human norovirus, HuNoV),至少包括30種以上的基因型,其中GⅡ.4是造成全球NoV暴發(fā)和流行的主要基因型[7]。但在2014―2015年冬季,日本和中國上海、北京、浙江、江蘇、廣東等東亞地區(qū)都相繼出現(xiàn)新型GⅡ.17,成為AGE暴發(fā)的主導(dǎo)毒株[8]。此外,2016年10―12月,中國NoV病例暴發(fā)數(shù)與前4年同期相比大幅增加,79%由重組株GⅡ.P16-GⅡ.2引起[9]。

    2 感染及致病機(jī)制

    HuNoV尚未能常規(guī)培養(yǎng),而且缺乏有效的動物疾病模型,因此對HuNoV的感染及致病機(jī)制仍未十分了解。目前HuNoV感染及致病數(shù)據(jù)主要來源于志愿者攻毒試驗(yàn),志愿者攻毒試驗(yàn)對HuNoV感染后發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義,但實(shí)踐中受許多因素的限制,如不能針對特定基因缺陷的個體,獲取感染時的組織樣本也頗受限制。因此,考慮到基因和環(huán)境因素的可操作性,動物感染模型多應(yīng)用于NoV與宿主間相互作用的研究,如無菌豬、無菌牛、黑猩猩、免疫缺陷小鼠等。其中應(yīng)用最廣泛的為鼠諾如病毒(murine norovirus, MuNoV)感染系統(tǒng)。

    2.1 NoV的細(xì)胞嗜性

    近年來,體內(nèi)、外研究顯示NoV對免疫細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞(enterocyte)具有感染性。在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中,MuNoV能感染巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和B細(xì)胞[10-11];而HuNoV能低程度感染B細(xì)胞[12],卻不能感染巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞[13],可見HuNoV與MuNoV的細(xì)胞嗜性不盡相同。更加有趣的是,無論是HuNoV還是MuNoV,在B細(xì)胞中復(fù)制都不會造成明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE),而在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中復(fù)制則會引起細(xì)胞裂解。與此發(fā)現(xiàn)相一致的是,MuNoV能在B細(xì)胞卻不能在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中持續(xù)感染[14]。這些現(xiàn)象令人頗為驚訝,因?yàn)橛邪さ牟《究梢酝ㄟ^出芽的方式從細(xì)胞內(nèi)釋放,而NoV作為無包膜的病毒理論上需裂解細(xì)胞才能釋放出后代病毒顆粒。

    作為感染腸道、引起腹瀉的HuNoV,它們的靶細(xì)胞一直被認(rèn)為是腸上皮細(xì)胞,這些假設(shè)已在早期的人體攻毒實(shí)驗(yàn)和活組織檢查(biopsy)中[15]得到初步證實(shí)。與此類似,在HuNoV感染無菌牛和無菌豬的腸組織中,檢測到NoV陽性的腸上皮細(xì)胞[16-17]。此外,Ettayebi等[18]在體外干細(xì)胞來源的人類類腸細(xì)胞中成功復(fù)制HuNoV,進(jìn)一步證實(shí)腸上皮細(xì)胞是HuNoV的宿主細(xì)胞。最近,Wilen等[19]發(fā)現(xiàn)一種罕見的腸上皮細(xì)胞——叢細(xì)胞(tuft cell),它能表達(dá)CD300If,是小鼠腸道MuNoV的靶細(xì)胞,且2型細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)叢細(xì)胞增殖促進(jìn)MuNoV感染。需要指出的是,盡管NoV能感染腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞,而且基于腸上皮細(xì)胞和免疫B細(xì)胞的HuNoV培養(yǎng)系統(tǒng)[12, 18]已被建立,但其培養(yǎng)條件苛刻、復(fù)雜且隨基因型變化,導(dǎo)致HuNoV復(fù)制效率低下,難以用于中和抗體檢測。所以NoV的體外培養(yǎng)仍是細(xì)胞嗜性研究中的一大挑戰(zhàn)。

    病毒感染需要跨越腸上皮屏障,轉(zhuǎn)移至下層免疫細(xì)胞,進(jìn)而有效誘導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)。在這個過程中,一種特化的腸上皮細(xì)胞——M細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。M細(xì)胞位于腸腔的派爾集合(Peyer’s patches)淋巴結(jié)并散布在淋巴濾泡中,雖然其頂端表面缺乏微絨毛,也不分泌黏液,但能選擇性攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)抗原至下層免疫細(xì)胞[20]。很多病原體能利用M細(xì)胞跨越腸上皮屏障,如依賴CXCR4受體蛋白的嗜淋巴細(xì)胞(X4)可與M細(xì)胞上的CXCR4受體結(jié)合,穿過上皮細(xì)胞[21]。研究顯示,NoV也可利用M細(xì)胞穿過腸上皮屏障。首先,即使在沒有病毒復(fù)制和破壞腸上皮細(xì)胞完整性的情況下,M細(xì)胞也能介導(dǎo)HuNoV和MuNoV通過極化的單層腸上皮細(xì)胞,在頂部內(nèi)化,然后在基底部釋放,釋放的病毒仍能有效地感染基室內(nèi)潛在的免疫細(xì)胞[22]。M細(xì)胞表達(dá)的特異性表面蛋白受體如b1整合素和糖蛋白2可能有助于病毒顆粒的黏附而協(xié)助感染活動[23]。此外,Gonzalez-Hernandez等[22]發(fā)現(xiàn)在M細(xì)胞缺失的小鼠中,兩種不同的MuNoV毒株復(fù)制均減少,但僅為減少而不是完全消失,這表明存在額外的病毒攝取途徑,可穿過腸上皮屏障。無論如何,這些結(jié)果直接或間接地支持了NoV利用M細(xì)胞跨越屏障并感染免疫細(xì)胞的假說。

    2.2 NoV受體或附著因子及個體易感染性

    腸上皮表面的組織血型抗原(histo-blood group antigens,HBGA)被認(rèn)為是NoV的宿主受體或附著因子[24],與HBGA的相互作用使得NoV得以附著宿主細(xì)胞,啟動病毒感染。HBGA是一類含巖藻糖的復(fù)合糖類,除了分布在紅細(xì)胞表面,還廣泛分布在呼吸道、泌尿生殖道和消化道黏膜細(xì)胞表面,也可以游離寡聚糖的形式存在于生物體液中,如唾液、腸液、乳汁和血液[25]。HBGA包括常見的H/A/B抗原(對應(yīng)O/A/B血型),以及Lea、Leb、Lex、Ley抗原(對應(yīng)Lewis血型)。H/A/B抗原分別在HBGA前體的基礎(chǔ)上由對應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶(分別叫FUT2、A酶和B酶)催化形成,Lewis血型則由FUT3酶催化產(chǎn)生。不同HBGA表型的個體與NoV結(jié)合能力不同。有研究顯示,有些NoV,比如諾瓦克病毒GI.1,與H/A抗原的結(jié)合能力高于B抗原[26];使得O表型的個體相對于B表型的個體更容易被諾瓦克病毒感染[27]。

    FUT2基因編碼α(1,2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,該糖基轉(zhuǎn)移酶可在HBGA前體上加上一個α(1,2)-巖藻糖,使之成為ABO抗原的前體H抗原。具備FUT2基因和FUT2酶活性的個體,被稱為“分泌型”(secretor);約有20%的個體因FUT2基因突變導(dǎo)致FUT2酶失活,從而不能表達(dá)ABO抗原,被稱為“非分泌型”(non-secretor)。在歐美國家,F(xiàn)UT2基因的428 (G→A)純合無義突變最常見,該突變導(dǎo)致無法合成H抗原,所以這些個體被稱為非分泌型;而在亞洲國家,F(xiàn)UT2基因的385 (A→T)錯義突變更普遍,突變后仍可表達(dá)低水平的H抗原,這些個體常被稱為“弱分泌型”[28]。

    分泌型個體對大多數(shù)NoV,尤其是常見的 GⅡ.4 NoV易感,而非分泌型個體對大部分NoV耐受,所以NoV感染有基因型特異性,其中基因型GⅠ.1和GⅡ.4表現(xiàn)尤為顯著[29]。然而在分泌型個體中,也有部分抵抗NoV感染,說明HBGA基因遺傳的差異并不能完全解釋NoV的易感性,免疫記憶或其他一些未知的因素也可能對NoV感染提供保護(hù)作用。此外,研究顯示非分泌型個體也對特定基因型的NoV敏感[30-31]。比如,Shirato等發(fā)現(xiàn)GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.4、GⅠ.8、GⅡ.4和GⅡ.7能夠與Lea抗原(非分泌型個體特有的血型抗原)結(jié)合;在瑞典GⅠ.3 NoV暴發(fā)調(diào)查中發(fā)現(xiàn),不同表型的個體之間發(fā)病情況沒有明顯差異,且GⅠ.3也能和Lea抗原結(jié)合[30];分別由GⅡ.3和GⅡ.4引起的胃腸炎暴發(fā)事件中,都出現(xiàn)了非分泌型個體發(fā)病的情況。這些研究結(jié)果的差異也可能由于地區(qū)、種族、毒株變異等不同引起。因此,NoV的易感和耐受機(jī)制需要進(jìn)一步探索和驗(yàn)證,尤其是那些文獻(xiàn)中不曾記載的基因型。早期研究表明,HBGA結(jié)合位點(diǎn)在P區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)[32],進(jìn)一步通過P區(qū)結(jié)構(gòu)域和HBGA寡聚糖共結(jié)晶及X-射線分析[33]顯示,HBGA結(jié)合位點(diǎn)位于NoV突出區(qū)結(jié)構(gòu)域的頂端(P2區(qū)),即病毒的最外端。該位點(diǎn)屬于構(gòu)象型結(jié)構(gòu)(conformational structure),由數(shù)個不連續(xù)的氨基酸構(gòu)成。HBGA結(jié)合位點(diǎn)在GⅠ和GⅡ基因組(genogroup)內(nèi)各自保守??傮w而言,它們大致可分為兩大區(qū)域,分別是中心部位的保守區(qū)和周圍的高變區(qū)[25, 34-35]。中心保守區(qū)為NoV感染宿主關(guān)鍵處,即為病毒存活所必須,而高變區(qū)對NoV進(jìn)化及擴(kuò)展易感人群具有重要意義。

    2.3 腸道共生菌對NoV感染的影響

    腸道共生菌在調(diào)節(jié)病毒感染方面也發(fā)揮了重要作用。Jones等[11]通過HuNoV感染B細(xì)胞系的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),腸道共生菌表面表達(dá)的人類HBGA受體能夠促進(jìn)NoV感染B細(xì)胞。此外,腸道菌群可能通過抑制誘導(dǎo)IFN-λ信號,直接或間接促進(jìn)病毒復(fù)制[36]。而利用抗生素消耗小鼠腸道內(nèi)微生物群后發(fā)現(xiàn),MuNoV的復(fù)制水平降低,從側(cè)面印證了腸道共生菌能夠促進(jìn)NoV感染[37]。相反,Lei等[38]通過HuNoV感染無菌豬的體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),腸道共生菌(E.cloacae)會抑制HuNoV感染,病毒顆粒脫落減少,腸道組織中的病毒滴度降低,且沒有在B細(xì)胞中觀察到HuNoV感染。與此類似,Lee等[39]利用RAW264.7細(xì)胞系體外驗(yàn)證了乳桿菌(Lactobacillus)抗MuNoV感染的作用。由此看來,腸道共生菌對于HuNoV或MuNoV感染的作用并沒有很好的一致性,可能受到體內(nèi)和體外試驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)動物模型、感染細(xì)胞系種類等多種因素的潛在影響,這些問題有待將來的研究澄清。

    2.4 NoV感染導(dǎo)致的病理學(xué)變化

    在HuNoV攻毒試驗(yàn)中,給予志愿者諾瓦克病毒(Norwalk; GⅠ.1)或夏威夷病毒 (Hawaii; GⅡ.1)后取其近端小腸活檢標(biāo)本。鏡檢顯示,腸絨毛鈍化變寬,微絨毛縮短,線粒體變大,隱窩細(xì)胞增生,胞質(zhì)空泡形成,多核和單核細(xì)胞滲入固有層,表現(xiàn)出輕微的炎癥浸潤。雖然NoV感染志愿者顯現(xiàn)腸上皮細(xì)胞異常,但細(xì)胞和黏膜卻保持完整狀態(tài)[15, 40-41], 胃底和胃竇內(nèi)未見組織學(xué)改變[42]。小腸刷狀緣酶活性(堿性磷酸酶、蔗糖酶和海藻糖酶)下降,造成輕度脂肪痢和短暫碳水化合物吸收不良[43]??漳c腺苷酸環(huán)化酶活性并沒有升高,胃酸、胃蛋白酶的分泌以及其他內(nèi)在因素可能與這些組織學(xué)改變有關(guān)。而胃排空延遲、胃動力減弱可能與胃腸炎的惡心、嘔吐癥狀有關(guān)[44]??傮w而言,由于缺乏有效的NoV感染致病動物模型,由HuNoV感染引起的AGE的致病機(jī)制目前還不是很清楚,有待進(jìn)一步研究來解釋。

    3 NoV感染的診斷學(xué)

    雖然在直腸拭子和嘔吐物中都可以檢測到NoV,但糞便中病毒含量相對較高,故將其作為臨床首選標(biāo)本。在1990年NoV基因組成功克隆和測序之前[45],電子顯微鏡(electron microscopy, EM)是檢測病毒的唯一方式。根據(jù)第1批病毒的收集地點(diǎn)和EM觀察到的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),將其命名為諾瓦克樣(美國俄亥俄州諾瓦克鎮(zhèn))病毒或小圓結(jié)構(gòu)病毒(small round structural virus),現(xiàn)正式命名為諾如病毒。由于EM觀察的NoV分辨率低,不易與其他胃腸炎病毒區(qū)分,而且該方法耗時、昂貴,不適宜在日常診斷中使用。此外,由于NoV基因型和抗原性的多樣性以及抗原漂移的存在,對酶免疫試驗(yàn)(enzyme immunoassay, EIA)試劑盒的研發(fā)及應(yīng)用構(gòu)成困難和挑戰(zhàn)。

    3.1 分子生物學(xué)診斷

    20世紀(jì)90年代,開發(fā)了第1個針對NoV ORF1區(qū)聚合酶基因(region A)的傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)[46]。隨著可利用序列的增加,RT-PCR方法被不斷優(yōu)化,特別是改善引物設(shè)計使其具有廣譜反應(yīng)性,現(xiàn)能檢測絕大部分的NoV流行株[47]。NoV廣譜RT-PCR的關(guān)鍵就是找到可用作PCR引物的保守序列,擴(kuò)增特定區(qū)域后可用于測序、分型。這些區(qū)域包括編碼聚合酶的基因(region A和B)以及編碼衣殼蛋白的基因(region C、D和E),其中最常用的是region A和region C,比較多聚酶和衣殼序列可判斷毒株是否重組[47]。《諾如病毒感染暴發(fā)調(diào)查和預(yù)防控制技術(shù)指南》(2015版)方案推薦利用衣殼蛋白的部分區(qū)域(region C)來對NoV進(jìn)行分型,引物G1SKF、G1SKR和CoG2F、G2SKR分別用于GⅠ和GⅡ的檢測[48]。

    與傳統(tǒng)的RT-PCR相比,實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-quantitative PCR assays, RT-qPCR)具有更高的靈敏度和特異度,使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針,不需要瓊脂糖凝膠電泳分析。一步法RT-qPCR試驗(yàn)中,反轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增在一個反應(yīng)中進(jìn)行,樣品處理更加簡單,降低了交叉污染的風(fēng)險,更適合于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測。雖然目前很多PCR針對病毒的聚合酶基因,但序列分析顯示ORF1-ORF2連接處的保守區(qū)域也可作為引物和探針設(shè)計[49]。盡管美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)還沒有批準(zhǔn)商業(yè)化NoV RT-qPCR檢測試劑盒,但該方法顯然已經(jīng)成為NoV檢測的金標(biāo)準(zhǔn),用于檢測糞便、嘔吐物、血清、食物、水等多種形式的標(biāo)本。而且,RT-qPCR設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控,可以減少假陰性結(jié)果,并能同步檢測GⅠ、GⅡ和GⅣ株[50-51]。同時,RT-qPCR可以半定量方式測定樣本中的病毒載量。研究顯示,病毒載量高的患者病毒脫落時間更長,通常GⅡ基因組的糞便病毒載量高于GⅠ組[52]。但是,RT-qPCR分析靈敏度高,可以檢測到含量極低的病毒,無癥狀的感染者或幾周前感染現(xiàn)已恢復(fù)的個體中仍可能檢測到NoV,因此,若癥狀發(fā)作后超過3~5 d收集樣品并具有高循環(huán)閾值(即低病毒載量),應(yīng)謹(jǐn)慎分析,以確定AGE的病因。

    3.2 多病原體檢測平臺

    近年來,多種胃腸道病原體檢測平臺相繼問世,能同時檢測十余種致病性腸道病毒、細(xì)菌和寄生蟲,較傳統(tǒng)方法更加靈敏、快捷,可用于臨床快速診斷。FDA批準(zhǔn)的xTAG Gastrointestinal Pathogen Panel (GPP) (Luminex, Austin, TX)平臺可以同步檢測包括NoV在內(nèi)的3種病毒、3種寄生蟲及7種細(xì)菌,并能區(qū)分NoV GⅠ/GⅡ基因組,其靈敏度>90%,特異度近100%[53]。與此類似,F(xiàn)ilmArray GI panel能夠同時檢測包括NoV在內(nèi)的23種病原,但不能區(qū)分NoV GⅠ和GⅡ基因組,除了個別的病原體,其總體靈敏度同樣>90%,特異度達(dá)100%。與xTAG GPP相比,F(xiàn)ilmArray GI樣品處理更簡單,出結(jié)果的時間更短,缺點(diǎn)是一次只能分析1個樣本,8 h只能處理7~8個樣本。相比之下,xTAG GPP通量更高,8 h能夠處理多達(dá)64個樣本,所以更適合大批量檢測。但是xTAG GPP是一個開放平臺,增加了復(fù)制子污染風(fēng)險,故應(yīng)使用單向工作流并注意實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范[54]。此外,Life Technologies開發(fā)的TaqMan Array Card (TAC)是點(diǎn)陣芯片卡RT-qPCR平臺,通過空間分布來實(shí)現(xiàn)多病原的檢測。它是由384個孔組成的微流體芯片卡,被分成8個區(qū)域,每個區(qū)域包括48個孔,預(yù)裝有特異性引物和TaqMan探針,每卡可加載8個樣本,同時檢測19種病原。與使用相同引物和探針的RT-PCR Luminex assay相比,TAC的靈敏度為100%,特異度為96.2%[55]。雖然這些檢測平臺可以快速診斷多種病原,但因經(jīng)常出現(xiàn)混合感染和缺乏定量數(shù)據(jù),故可能無法確定胃腸道疾病是由哪種病原造成,需要通過別的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

    3.3 二代測序

    二代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)因具有高通量、高靈敏度等優(yōu)勢而被廣泛用于基因組學(xué)的研究。NGS可不依賴于特異性引物而得到NoV的全基因組序列,及時發(fā)現(xiàn)異于常見毒株的新突變株,豐富參考序列數(shù)據(jù)庫,追蹤NoV的起源和基因進(jìn)化,從而預(yù)測其潛在的暴發(fā)和流行。NGS一個極大的優(yōu)勢是,所有病毒(高于敏感閾值)都可在產(chǎn)生的序列中表示,為臨床樣本提供重要的共感染數(shù)據(jù)[56]。然而,NGS從文庫制備到測序分析需要至少24~48 h,且需要專門的人員和設(shè)備;另外,價格昂貴,每個樣本需要100~200美元。NGS對于低豐度病毒的測序非常有用,但這也提高了樣本之間發(fā)生交叉污染的風(fēng)險。

    4 展望

    目前,對HuNoV感染致病機(jī)制的了解大部分來自人體攻毒試驗(yàn)研究,以及主要利用小鼠模型進(jìn)行的替代研究。這些模型受成本、試劑和倫理的限制。盡管小鼠模型成本低廉,但無法繁殖HuNoV。MuNoV和HuNoV在與宿主的相互作用及引起疾病方面有很大差異。因此,未來的致病機(jī)制研究應(yīng)聚焦更能代表人小腸上皮細(xì)胞的體內(nèi)與體外模型的構(gòu)建,包括能感染HuNoV的動物感染與疾病模型,以及人小腸類器官模型。此外,還應(yīng)關(guān)注腸道微生態(tài)與HuNoV感染、復(fù)制和致病的相關(guān)性,以全面理解NoV的致病機(jī)制,為疫苗和治療藥物的研發(fā),乃至最終治療和預(yù)防NoV胃腸炎提供不可或缺的基礎(chǔ)。

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