酸、鎘脅迫對(duì)金絲草種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及亞顯微結(jié)構(gòu)的影響

趙雅曼，陳順鈺，李宗勛，李啟艷，侯曉龍,2,3*，蔡麗平,2,3

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002；3.南方紅壤區(qū)水土保持國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

土壤酸化和重金屬污染是社會(huì)和人民群眾關(guān)注的主要環(huán)境問(wèn)題之一，而一些金屬礦開(kāi)采廢棄地土壤酸化和重金屬污染往往同時(shí)存在[1-4]。不論土壤酸化還是重金屬污染均會(huì)導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)變差、肥力降低，影響作物、林木等植物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致其枯萎、死亡，同時(shí)也嚴(yán)重威脅到人類的身體健康，因此，土壤酸化和重金屬污染的治理成為當(dāng)前亟須解決的重大課題[5]。植物修復(fù)不僅可以快速增加植被覆蓋，而且可以改良土壤，減少土壤污染，相比物理化學(xué)治理方法具有生態(tài)環(huán)保、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，受到人們的普遍青睞[6]。

植物修復(fù)的前提是富集和耐性植物的篩選，在此方面國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了大量研究，篩選出了不少適合酸性土壤或重金屬污染廢棄地應(yīng)用的植物[7-9]。金絲草(Pogonatherumcrinitum)是從鉛鋅(Pb,Zn)礦區(qū)篩選出的一種Pb超富集植物，可以在土壤Pb含量小于20000 mg·kg-1的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，對(duì)Pb有強(qiáng)的耐性和富集能力[10]。金絲草為多年生草本植物，具有耐貧瘠、生長(zhǎng)速度快、分布范圍廣等特點(diǎn)，在土壤Pb污染植物修復(fù)上有廣泛的應(yīng)用前景[11]。

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)的初始階段，也是最關(guān)鍵和最脆弱的環(huán)節(jié)，容易受到病害、機(jī)械損傷和環(huán)境脅迫的影響，是進(jìn)行抗逆性研究的重要時(shí)期之一[12]。低Pb濃度(50 mg·L-1)對(duì)金絲草種子萌發(fā)有一定促進(jìn)作用，Pb脅迫對(duì)金絲草根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)無(wú)顯著影響[13]。金絲草生長(zhǎng)的鉛鋅礦區(qū)土壤除了鉛污染嚴(yán)重外，同時(shí)還存在土壤酸化和鎘污染的問(wèn)題[14]，但是，金絲草是否對(duì)酸和鎘脅迫具有一些特殊的響應(yīng)策略尚不清楚。

鑒于此，以超富集植物金絲草種子為試驗(yàn)材料，設(shè)計(jì)不同pH(5.5、4.5、3.5)和Cd2+濃度(5、10、20 mg·L-1)的脅迫試驗(yàn)，在人工氣候培養(yǎng)箱中開(kāi)展金絲草種子對(duì)酸和鎘脅迫的響應(yīng)研究，測(cè)定不同酸和鎘脅迫條件下金絲草種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、生物量、質(zhì)膜完整性和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)，揭示金絲草種子萌發(fā)對(duì)酸和鎘脅迫的響應(yīng)，分析金絲草幼苗生長(zhǎng)、生物量分配、質(zhì)膜變化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)酸和鎘脅迫的響應(yīng)策略，以期為植物修復(fù)復(fù)合土壤污染技術(shù)提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用金絲草種子于2017年夏采自福建尤溪鉛鋅礦區(qū)的金絲草植株，種子采集后存于4 ℃冰箱。將采集的金絲草種子置于0.3%的高錳酸鉀溶液中，室溫條件下浸泡30 min后用純水沖洗數(shù)遍，然后置于純水中浸泡24 h。試驗(yàn)中酸和Cd脅迫溶液分別采用分析純?cè)噭〤H3COOH和Cd(CH3CO2)2配制，試驗(yàn)處理分別為pH 5.5、4.5、3.5和Cd 5、10、20 mg·L-1，同時(shí)采用pH值為6.1的純水作為對(duì)照。2018年1月在LT-ACC400人工氣候箱中進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，空氣濕度75%，光照強(qiáng)度10000 Lx，晝/夜光照時(shí)間為(14/10) h·d-1[15]。試驗(yàn)采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行，在9 cm培養(yǎng)皿中鋪放兩層濾紙并加入5 mL相應(yīng)處理的脅迫液，選取50粒長(zhǎng)勢(shì)飽滿、均一的種子于每個(gè)培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)期間每48 h更換一次濾紙和脅迫液以保證脅迫環(huán)境的穩(wěn)定，以胚根突破種皮1 mm為發(fā)芽標(biāo)志，每24 h統(tǒng)計(jì)一次發(fā)芽數(shù)，以連續(xù)5 d萌發(fā)數(shù)一致為種子發(fā)芽結(jié)束的標(biāo)志。試驗(yàn)第4天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第13 天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.1種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定[15]

發(fā)芽率=(萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù))×100%

發(fā)芽勢(shì)=(發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)/種子總數(shù))×100%

發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)=∑(Gt/Dt)

活力指數(shù)(vigor index,VI)=GI×g

式中：Gt為在t時(shí)間內(nèi)萌發(fā)數(shù)；Dt為相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù)；g為芽長(zhǎng)度+根長(zhǎng)度。

1.2.2胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和生物量的測(cè)定 萌發(fā)結(jié)束后，每盤(pán)選取20株長(zhǎng)勢(shì)相似的幼苗，參考魯如坤[16]的方法測(cè)量其胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)。并快速測(cè)量胚根和胚芽的鮮重，然后在105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重后稱量其干重。

1.2.3萌發(fā)抑制指數(shù)[15]

抑制指數(shù)(restrain index，RI)=(對(duì)照指標(biāo)值-處理指標(biāo)值)/對(duì)照指標(biāo)值

當(dāng)RI<0，酸、Cd脅迫對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)起促進(jìn)作用；當(dāng)RI>0，酸、Cd脅迫對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)起抑制作用；當(dāng)RI=0，酸、Cd脅迫對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)無(wú)明顯作用。

1.2.4測(cè)定質(zhì)膜完整性和細(xì)胞相對(duì)活性 采用Evans blue染色的方法檢測(cè)金絲草幼苗根尖質(zhì)膜完整性[17]。從各處理組中分別取長(zhǎng)度為2 cm左右的金絲草幼苗根尖，在4 ℃冷處理pH 4.5的 0.5 mmol·L-1CaCl2溶液中浸泡5 min后純水洗凈吸干，在4 mL 伊文思藍(lán)溶液(0.025% 伊文思藍(lán)溶于pH 5.6 的100 μmol·L-1CaCl2溶液中)中浸泡30 min，洗凈吸干后在純水中浸泡15 min，在LEICA M205 FA全電動(dòng)熒光立體顯微鏡下觀察拍照。

利用Image-J軟件對(duì)根尖照片進(jìn)行處理，細(xì)胞相對(duì)活性計(jì)算公式如下[18]：

V=A/At×100%

式中：V為細(xì)胞相對(duì)活性，A為根尖非染色區(qū)域面積，At為全根尖面積。

1.2.5胚芽超顯微結(jié)構(gòu)的測(cè)定 發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，在各處理組中各選取長(zhǎng)勢(shì)相似的3株幼苗，用4 ℃預(yù)冷的PBS(pH 7.4)溶液清洗1～2次，去除殘留的雜質(zhì)，然后將樣品放入1 mL 2.5% 戊二醛溶液(用PBS配制)中，充分浸沒(méi)組織，在 4 ℃固定過(guò)夜后立即用干冰保存，送于上海秉新生物科技有限公司使用透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit)對(duì)金絲草胚芽組織進(jìn)行檢測(cè)，并采用能譜儀(EDS)對(duì)胚芽組織選定區(qū)域(圖中紅色圓圈區(qū)域)進(jìn)行掃描，對(duì)重金屬含量進(jìn)行定性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013和SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s法在0.05水平上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，圖表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Origin 8.5作圖。

采用隸屬函數(shù)法對(duì)不同處理下的金絲草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[19]，計(jì)算公式如下：如指標(biāo)與抗逆性呈正相關(guān)時(shí)：

指標(biāo)與抗逆性呈負(fù)相關(guān)時(shí)，則用反隸屬函數(shù)計(jì)算：

綜合隸屬函數(shù)值：

2 結(jié)果與分析

2.1 酸、鎘脅迫對(duì)金絲草種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

由表1可知，酸脅迫下金絲草種子的各萌發(fā)指標(biāo)均隨pH的減小呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，但不同酸脅迫處理金絲草種子的發(fā)芽率均與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)；pH 5.5處理金絲草種子的發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)，但發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著大于對(duì)照(P<0.05)；pH 3.5處理，金絲草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著小于對(duì)照(P<0.05)；隨Cd脅迫濃度的增大，金絲草種子的活力指數(shù)呈減小趨勢(shì)，且不同處理均顯著小于對(duì)照(P<0.05)；Cd 5處理下金絲草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)，Cd 20處理下各萌發(fā)指標(biāo)則均顯著小于對(duì)照(P<0.05)。

表1 不同酸、鎘脅迫下金絲草種子的萌發(fā)指標(biāo)

注：同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: The different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments atP<0.05 levels.

2.2 酸、鎘脅迫對(duì)金絲草幼苗胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和根冠比的影響

由圖1可知，pH 5.5和4.5處理金絲草幼苗的胚根長(zhǎng)和根冠比均與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)，pH 5.5處理顯著大于pH 4.5處理(P<0.05)，pH 3.5處理的金絲草幼苗的胚根長(zhǎng)和根冠比均顯著小于對(duì)照(P<0.05)；酸脅迫對(duì)金絲草幼苗胚芽長(zhǎng)無(wú)顯著影響(P>0.05)；隨著Cd濃度的增大，金絲草幼苗胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和根冠比均呈減小趨勢(shì)，不同Cd脅迫處理金絲草幼苗的胚根長(zhǎng)、根冠比均顯著小于對(duì)照(P<0.05)，Cd 5處理的胚芽長(zhǎng)與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 酸、鎘脅迫對(duì)金絲草幼苗生物量的影響

由圖2可知，酸脅迫下金絲草幼苗胚根鮮重呈減小趨勢(shì)，且不同處理均顯著小于對(duì)照(P<0.05)；pH 4.5處理下金絲草幼苗的胚芽鮮重顯著小于對(duì)照(P<0.05)，其他處理則與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)；pH 3.5處理金絲草幼苗胚根干重顯著小于對(duì)照(P<0.05)，胚芽干重則與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)，但顯著大于其他酸脅迫處理(P<0.05)。說(shuō)明pH 3.5處理會(huì)抑制胚根干重，但會(huì)促進(jìn)胚芽干重增加。 Cd脅迫條件下，金絲草幼苗的胚根重量呈減小趨勢(shì)，Cd 5處理下胚根鮮重、干重均顯著小于對(duì)照(P<0.05)，胚芽鮮重、干重呈先增后減趨勢(shì)，Cd 5處理下均顯著大于對(duì)照(P<0.05)；Cd 5處理下金絲草幼苗根系生物量受到抑制，但胚芽生物量則被促進(jìn)；Cd 10和20處理下金絲草幼苗胚根和胚芽的生物量均顯著小于對(duì)照(P<0.05)。

圖1 不同酸、鎘脅迫下金絲草幼苗胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和根冠比

圖2 不同酸、鎘脅迫下金絲草幼苗胚根和胚芽鮮重、干重

2.4 酸、鎘脅迫對(duì)金絲草萌發(fā)指標(biāo)和生長(zhǎng)指標(biāo)的抑制作用分析

由表2可知，酸脅迫可提高金絲草種子的發(fā)芽率，其中pH 5.5處理作用最明顯；pH 5.5處理對(duì)金絲草的各萌發(fā)指標(biāo)均為促進(jìn)作用，而pH 3.5處理則對(duì)除發(fā)芽率外的其他萌發(fā)指標(biāo)均有抑制作用；除了pH 5.5處理的胚根長(zhǎng)、pH 4.5處理的胚芽長(zhǎng)和pH 3.5處理的胚芽干重外，金絲草各生長(zhǎng)指標(biāo)均受到抑制作用，其中，胚根干重隨pH值的減小受到的抑制作用逐漸增加，而胚芽干重則相反。

隨著Cd濃度的增加，金絲草種子萌發(fā)指標(biāo)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)受到的抑制作用均逐漸增強(qiáng)，Cd 5處理對(duì)金絲草的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、胚芽長(zhǎng)、胚芽鮮重和胚芽干重具有一定促進(jìn)作用，其他處理各指標(biāo)均表現(xiàn)出抑制作用。

表2 酸、 鎘脅迫處理金絲草萌發(fā)指標(biāo)和生長(zhǎng)指標(biāo)的抑制指數(shù)

2.5 酸、鎘脅迫對(duì)金絲草幼苗根尖質(zhì)膜完整性的影響

由圖3可知，對(duì)照組根尖無(wú)明顯著色，隨著酸、Cd脅迫程度的增加，根尖著色逐漸加深，在pH 3.5和Cd 20處理下的根尖質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，染色最深(細(xì)胞相對(duì)活性僅為10%左右)，說(shuō)明根尖細(xì)胞膜的破損程度逐漸增加。

圖3 酸、鎘脅迫下金絲草幼苗根尖質(zhì)膜完整性

2.6 酸、鎘脅迫下金絲草幼苗胚芽細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)

2.6.1酸脅迫對(duì)金絲草幼苗胚芽細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響 由圖4可知，對(duì)照組金絲草胚芽細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核核膜完整清晰，圓球形線粒體數(shù)量較多，內(nèi)部管狀嵴分布均勻，清晰可見(jiàn)，葉綠體基粒和類囊體結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊(圖4-1，4-2)。pH 5.5處理下的部分胚芽細(xì)胞葉綠體外膜斷裂，產(chǎn)生髓樣結(jié)構(gòu)(圖4-3，4-4)。pH 4.5處理部分葉綠體內(nèi)膜破損，基粒出現(xiàn)彎曲變形，線粒體數(shù)量減少，管狀嵴密度降低(圖4-5，4-6)。pH 3.5處理下細(xì)胞膜斷裂，細(xì)胞核出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，部分葉綠體和線粒體等細(xì)胞器嚴(yán)重破裂，內(nèi)部蛋白質(zhì)和酶類等物質(zhì)外流，細(xì)胞受損嚴(yán)重(圖4-7，4-8)。

2.6.2鎘脅迫對(duì)金絲草胚芽細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響 由圖5可知，相較于對(duì)照，Cd 5處理細(xì)胞出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，葉綠體變形皺縮成近球形，外膜斷裂，基粒排列混亂，類囊體扭曲變形，細(xì)胞基質(zhì)中開(kāi)始出現(xiàn)大量黑色顆粒(圖5-9, 5-10)。Cd 10處理下細(xì)胞受損加劇，葉綠體內(nèi)膜破裂，基質(zhì)外流，部分細(xì)胞細(xì)胞器破損嚴(yán)重，開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞空泡化現(xiàn)象，并且同樣存在大量黑色顆粒(圖5-11, 5-12)。Cd 20處理下細(xì)胞核、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器皆破裂消失，細(xì)胞空泡化現(xiàn)象加劇，細(xì)胞壁周?chē)练e大量黑色顆粒(圖5-13, 5-14)。對(duì)Cd脅迫下的金絲草胚芽細(xì)胞進(jìn)行能譜分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，胚芽細(xì)胞內(nèi)均沉積了一定量的重金屬Cd，其峰值低于Cl，且均吸附于0.3～0.6 keV和2.5～4 keV位點(diǎn)間，證明了Cd是存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞基質(zhì)中的黑色顆粒物的主要成分之一。

圖4 酸脅迫下金絲草幼苗胚芽細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)

圖5 Cd脅迫下金絲草幼苗胚芽細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)

圖6 Cd脅迫下金絲草幼苗胚芽細(xì)胞能譜圖

2.7 金絲草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)酸和鎘脅迫的耐性評(píng)價(jià)

2.7.1酸、鎘脅迫處理下金絲草各萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)性分析 由表3可知，各形態(tài)指標(biāo)之間、指標(biāo)和處理之間均存在不同程度的相關(guān)性，其中發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、芽長(zhǎng)、芽干重和處理間均有顯著相關(guān)性(P<0.05)，且發(fā)芽率和芽長(zhǎng)與處理間為極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；另外，發(fā)芽率和芽長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，活力指數(shù)和根長(zhǎng)、根干重極顯著正相關(guān)，根長(zhǎng)和根鮮重、根干重極顯著正相關(guān)(P<0.01)。而發(fā)芽勢(shì)與處理和其他各指標(biāo)間均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。發(fā)芽率和芽長(zhǎng)可作為判斷金絲草耐酸和Cd脅迫程度的關(guān)鍵指標(biāo)。

表3 酸、鎘處理下金絲草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)各形態(tài)指標(biāo)之間的相關(guān)性

注：** 表示在 0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，* 表示在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

Note: ** indicates significant correlation at 0.01 level (both sides), * indicates significant correlation at 0.05 level (both sides).

2.7.2酸、鎘脅迫下金絲草各形態(tài)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值 根據(jù)相關(guān)性分析的結(jié)果，運(yùn)用隸屬函數(shù)法對(duì)有顯著相關(guān)性的萌發(fā)和生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。由表4可知，不同處理下的金絲草萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的綜合隸屬函數(shù)值大小為pH 5.5>CK>pH 4.5>Cd 5>pH 3.5>Cd 10>Cd 20。酸、Cd脅迫下的綜合隸屬函數(shù)值均隨脅迫的增強(qiáng)而減小，且僅有pH 5.5處理的綜合隸屬函數(shù)值大于對(duì)照，是對(duì)照的1.034倍，說(shuō)明弱酸處理有助于金絲草的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)；Cd處理的綜合隸屬函數(shù)值均小于對(duì)照，其中Cd 20處理對(duì)金絲草的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用最大。

表4 不同酸和鎘脅迫下金絲草各萌發(fā)和生長(zhǎng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

3 討論

逆境脅迫環(huán)境會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，本試驗(yàn)采用不同pH和Cd溶液對(duì)金絲草種子進(jìn)行脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸處理均會(huì)促進(jìn)種子的萌發(fā)，且脅迫下金絲草種子萌發(fā)指標(biāo)呈先增后減趨勢(shì)，均在pH 5.5達(dá)到最大值, 呈現(xiàn)“低促高抑”現(xiàn)象；酸脅迫對(duì)萌發(fā)指標(biāo)的抑制作用表現(xiàn)為pH 3.5>pH 4.5>pH 5.5。歐陽(yáng)玲[20]研究發(fā)現(xiàn)白三葉(Trifoliumrepens)種子的萌發(fā)指標(biāo)均隨酸度的增加(pH 7.0～2.0)呈先增加后減小趨勢(shì)，在pH 6.0達(dá)到萌發(fā)指標(biāo)的最大值，本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致。楊舒貽等[21]對(duì)強(qiáng)酸脅迫下大葉相思(Acaciaauriculiformis)幼苗的抗性生理機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在pH值為3.0和2.0環(huán)境下，幼苗丙二醛(MDA)含量無(wú)顯著變化，且谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶在pH 2.0脅迫下無(wú)顯著變化，但在pH 3.0脅迫下會(huì)顯著上升等，pH 3.0可能是大葉相思幼苗耐強(qiáng)酸脅迫的生理調(diào)節(jié)閾值。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)pH 6.1～4.5處理對(duì)金絲草幼苗胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、胚根干重?zé)o顯著影響(P>0.05)，但胚根長(zhǎng)隨酸度的增加呈先增后減趨勢(shì)，在pH 5.5達(dá)到最大值；且胚根長(zhǎng)、胚根干重隨pH值的減小(pH 5.5～3.5)受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)，胚芽干重則相反。張玉秀等[22]研究發(fā)現(xiàn)，紫穗槐(Amorphafruticosa)根長(zhǎng)在pH 3.0～4.5 處理間迅速增加，然后隨著pH的升高逐漸減小，且在pH 4.5～5.0達(dá)到最大值，pH 3.0脅迫明顯抑制根生長(zhǎng)。張海艷[23]研究發(fā)現(xiàn)，pH 5.0～2.0脅迫環(huán)境對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)沒(méi)有顯著抑制作用，pH 1.0脅迫對(duì)玉米幼苗根系的抑制作用大于地上部分，本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致。這可能是因?yàn)樵谌跛崽幚硐陆鸾z草將有限的養(yǎng)分資源優(yōu)先分配到根部來(lái)適應(yīng)逆境，使根長(zhǎng)得到補(bǔ)償增長(zhǎng)來(lái)維持根系正常的生理功能，而低pH值可能導(dǎo)致根尖細(xì)胞分裂速度減慢或無(wú)法正常分裂，從而對(duì)根的伸長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。

Cd脅迫對(duì)金絲草的種子萌發(fā)指標(biāo)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的抑制作用均表現(xiàn)為Cd 20>Cd 10>Cd 5，其中Cd 5處理會(huì)促進(jìn)種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、胚芽長(zhǎng)、胚芽鮮重和胚芽干重。徐雅梅等[24]對(duì)野生垂穗披堿草(Elymusnutans)種子在Mn、Pb處理下的響應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)隨著Mn、Pb溶液濃度的升高，種子發(fā)芽指標(biāo)和胚根、胚芽長(zhǎng)出現(xiàn)了不同程度的減小趨勢(shì)；孫金金等[25]研究發(fā)現(xiàn)黑麥(Secalecereale)、燕麥(Avenasativa)、高丹草(Sorghumbicolor×Sorghumsudanense)和無(wú)芒雀麥(Bromusinermis)等禾本科草類的相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，以及幼苗的相對(duì)芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、芽重和根重均隨Cu、Cd和Pb脅迫濃度的增大呈降低趨勢(shì)，黑麥草(Loliumperenne)和高羊茅(Festucaarundinace)在高濃度脅迫下甚至出現(xiàn)“無(wú)根苗”現(xiàn)象，本研究結(jié)果與其一致。這可能是因?yàn)檫^(guò)量的重金屬離子會(huì)造成種子和幼苗產(chǎn)生過(guò)氧化毒害，造成細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，甚至導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡，影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[26-27]。

伊文斯藍(lán)染色通過(guò)植物染色深淺來(lái)評(píng)價(jià)其質(zhì)膜完整性，植物在受到逆境脅迫后積累的活性氧會(huì)導(dǎo)致植物MDA含量升高，而MDA 是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，也是判斷植物細(xì)胞膜破損程度的重要指標(biāo)之一[28]。李黎等[29]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)莖柱花草(Stylosanthesguianensisvar.intermedia)體內(nèi)的丙二醛含量隨低溫處理時(shí)間的增加而逐步升高。羅潔文等[30]研究發(fā)現(xiàn)，類蘆(Neyraudiareynaudiana)根系體內(nèi)的MDA含量隨Cd、Pb 脅迫濃度的增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其根系質(zhì)膜的著色變化與MDA含量變化相同，且在Cd、Pb濃度為100 μmol·L-1時(shí)著色最深。本試驗(yàn)對(duì)金絲草幼苗根尖進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫濃度的增加，染色程度逐漸加深，說(shuō)明根尖細(xì)胞膜的破損程度逐漸增加，進(jìn)一步在組織化學(xué)的層面上證明了酸、Cd處理對(duì)金絲草幼苗根系的影響，與以上研究結(jié)果一致。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，植物在逆境環(huán)境下會(huì)對(duì)體內(nèi)細(xì)胞器產(chǎn)生一定的損傷，特別是葉綠體、線粒體、細(xì)胞核等細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)胞壁被破壞，葉綠體基粒膨脹、溶解、數(shù)量減少，線粒體膜破損，內(nèi)嵴斷裂等現(xiàn)象發(fā)生[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CK處理下，葉肉細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)完好，隨著脅迫濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)壁分離嚴(yán)重，葉綠體膜破裂，出現(xiàn)髓狀物質(zhì)，基粒彎曲變形，線粒體管狀嵴排列混亂甚至消失，且在Cd 20處理下出現(xiàn)細(xì)胞空泡化現(xiàn)象，且Cd脅迫下的葉肉細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)中均可檢測(cè)出重金屬Cd顆粒，可能是細(xì)胞壁固持作用達(dá)到了飽和或受到了破壞，使Cd離子進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[33]。

4 結(jié)論

不同酸脅迫均對(duì)金絲草種子發(fā)芽率具有促進(jìn)作用，pH 5.5處理對(duì)金絲草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但pH 3.5處理則表現(xiàn)出較大抑制作用；5 mg·L-1Cd處理下金絲草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照無(wú)顯著差異，生物量顯著大于對(duì)照，但隨Cd脅迫濃度的增加，金絲草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)表現(xiàn)出抑制作用且呈逐漸增大趨勢(shì)；pH 大于3.5，Cd濃度小于10 mg·L-1對(duì)金絲草根尖質(zhì)膜和胚芽超微結(jié)構(gòu)影響較小，反之則破損嚴(yán)重，為金絲草耐受酸和Cd脅迫的閾值。