山藥皮中總黃酮的超聲輔助乙醇提取工藝研究

張金鳳 馬 雪 李 楊 柴云雷 馬麗媛 張雅娜

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院 黑龍江綏化 152061）

山藥又稱薯蕷、土薯、山薯蕷、懷山藥、淮山、白山藥，一年或多年生蔓生草本植物。山藥根莖肉質(zhì)潔白，營養(yǎng)豐富，兼食、藥為一體[1,44]。除含淀粉、黏液多糖、皂苷、黃酮、色素多酚類物質(zhì)、植酸、山藥堿、8大必須氨基酸等成分外，還含有鐵、磷、鈣等多種無機(jī)元素[2-3]，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)肺益腎的功效，可用于治療脾虛久瀉、慢性腸炎、慢性胃炎、肺虛咳喘、糖尿病、遺精和遺尿滯下等癥[4]。黃酮是一類以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的酚類化合物，多為結(jié)晶性固體，溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)不同而有很大差異。黃酮具有抗氧化、改善血液循環(huán)、降低膽固醇、抑制炎性生物酶滲出等作用。

目前，提取山藥中總黃酮的相關(guān)研究較多，孫亞琴[6]利用雙水相提取山藥總黃酮，研究表明，60℃時(shí)用PEG-磷酸氫二鉀提取山藥總黃酮的效果相對較好。周厚良[7]利用熱浸提法提取山藥中黃酮進(jìn)行工藝優(yōu)化，結(jié)果表明體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1：20，50℃提取120min 時(shí)提取率相對較高。徐東生[8]采用微波法提取山藥中的黃酮，研究最佳提取條件。但對于作為廢料丟棄的山藥皮研究的較少，僅趙立庭[9]和劉青[10]分別采用回流和索氏提取進(jìn)行山藥皮中黃酮的提取，然而回流和索氏提取一般耗時(shí)間比較長，故從整合資源限度最大利用及生產(chǎn)效率等角度考慮，本文以山藥皮為原料采用超聲波輔助乙醇提取總黃酮，在提高生產(chǎn)效率的同時(shí)提高山藥本身經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為其綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料與設(shè)備。山藥：綏化市售；蘆丁標(biāo)品：中國藥品生物制品鑒定所；亞硝酸鈉、無水乙醇、石油醚、硝酸鋁和氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

721型分光光度計(jì)，上海元析儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯樂儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

（二）實(shí)驗(yàn)方法。

1.山藥皮中黃酮的提取。稱取一定量的山藥，洗凈，剔皮，放入平面皿在干燥箱中60℃烘干，待冷卻，用粉碎機(jī)粉碎干燥的山藥皮碎片過50目篩。準(zhǔn)確稱取5g山藥皮粉，加入50mL95%乙醇浸泡2h，再用超聲波提取30min，抽濾，濾液用等體積的石油醚脫脂，再將濾液再進(jìn)行濃縮至10mL，放置100mL 容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，得總黃酮樣品液[1，44]。

2.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。分別吸取質(zhì)量濃度為0.1mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照液 0.0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL，3.0mL、4.0mL，5mL置于10ml容量瓶中，分別加入0.3mL亞硝酸鈉溶液（5%），充分搖勻，放置6min；再加入0.3mL 硝酸鋁溶液（10%），充分搖勻，放置6min，再加入4.0mL 氫氧化鈉溶液（4%），用80%乙醇定容至刻度，充分搖勻后，放置12min，以無蘆丁対照液所在的容量瓶為空白對照，510nm波長處測其吸光度（A）。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

3.樣品溶液含量測定。取待測樣液1mL放置于10mL容量瓶中，按2中標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法測定吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出樣品液濃度,計(jì)算提取率。

式中：C 根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃酮的含量，單位mg；

N為稀釋倍數(shù)；

V為待測液體積，單位mL；

M為樣品山藥皮質(zhì)量，單位g。

4.單因素試驗(yàn)。以總黃酮提取率為指標(biāo)，分別選取乙醇的體積、超聲功率、料液比及超聲時(shí)間作為單因素，進(jìn)行試驗(yàn)。從中選取適宜的條件，進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

5.響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲功率（B）、料液比（C）和超聲時(shí)間（D）為響應(yīng)因素編碼水平為-1、0、1，山藥皮中總黃酮的提取率（Y）為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的因素水平表，如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

二、結(jié)果與分析

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。根據(jù)方法2測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

（二）乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響。稱取6 組各5g 干燥山藥粉，在超聲波功率為300W，料液比為1：50 條件下，分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇浸泡2h，超聲處理20min。乙醇體積分?jǐn)?shù)對山藥皮中總黃酮提取率影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)從40%升高到70%山藥皮中總黃酮提取率增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，總黃酮提取率最大為0.366%，超過70%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率急劇下降，可能原因是提取過程中，乙醇濃度加大，提取溶液中低極性雜質(zhì)在提取溶劑中的含量不斷增加，導(dǎo)致溶液粘度增加，同時(shí)阻礙了黃酮類化合物的溶出，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)提取量降低。同時(shí)使黃酮穩(wěn)定性被破壞[8]。所以由圖2綜合分析考慮，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%較佳。

（三）超聲波功率對總黃酮提取率的影響。稱取6 組各5g干燥山藥粉，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1：50，超聲波功率分別為100W，150W，200W，250W，300W，350W 條件下，先將6組樣品乙醇浸泡2h，再在超聲波處理20min，超聲波功率對山藥皮中總黃酮提取率影響見圖3。

圖3 超聲波功率對總黃酮提取率的影響

由圖3 可以看出，隨著超聲波功率的增加，總黃酮的提取率也逐漸增加，并在300W 時(shí)達(dá)到最大，之后出現(xiàn)下降趨勢，總黃酮提取率之所以隨著超聲波功率的增加而提高，是由于當(dāng)超聲波在溶劑中傳播時(shí)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的剪切力，引起了山藥組織細(xì)微裂縫的形成。超聲波功率越大，超聲波在提取介質(zhì)中的振幅越大，剪切破碎越劇烈有效成分的提取率越高。而超聲波功率大到一定程度時(shí)，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)則會(huì)被破壞，因此山藥皮中總黃酮提取量不會(huì)隨著功率增加而抑制持續(xù)升高[12]。綜合考慮，選擇超聲波功率300W較好。

（四）料液比對總黃酮提取率的影響。稱取5組各1g干燥山藥粉，在超聲波功率為300W，分別加入10mL，20mL，30mL，40mL，50mL70%乙醇，超聲處理20min。液料比對山藥皮中總黃酮提取率影響見圖4。

圖4 液料比對總黃酮提取率的影響

由圖4 可以看出，隨著液料比的增大，提取率也隨之增加。但當(dāng)達(dá)到50：1之后，提取率出現(xiàn)小幅度下降。分析原因可能是，提取溶劑量越大，形成的細(xì)胞壁內(nèi)外濃度差越大，擴(kuò)散動(dòng)力增強(qiáng)，山藥皮中的有效成分越容易從細(xì)胞內(nèi)滲出，提取率越高。但溶劑用量過大，會(huì)導(dǎo)致除黃酮類以外的物質(zhì)溶出，從而導(dǎo)致提取率降低，并且在實(shí)際生產(chǎn)過程中，溶劑用量太大會(huì)給后續(xù)的濃縮造成困難，使工業(yè)生產(chǎn)效率下降。但是，液料比也不能過低，否則會(huì)使山藥皮中的黃酮類化合物則不能被充分溶出，導(dǎo)致最終提取率將偏低。綜合考慮，本研究選擇液料比50：1較適宜。

（五）超聲時(shí)間對總黃酮提取率的影響。稱取6組各5g干燥山藥粉，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1：50，超聲波功率300W，條件下，先將6組樣品乙醇浸泡2h，再在超聲波分別處理10min，15min，20min，25min，30min，35min，超聲波時(shí)間對山藥皮中總黃酮提取率影響見圖5。

圖5 超聲波時(shí)間對總黃酮提取率的影響

由圖5可知超聲時(shí)間在10-20min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，總黃酮的提取率在增大，但當(dāng)超聲時(shí)間超過20min后提取率出現(xiàn)下降，可能是加上前面2h的浸泡和超聲長時(shí)間處理導(dǎo)致溶劑乙醇大量揮發(fā)的原因，所以超聲時(shí)間20min為宜。

（六）響應(yīng)面模型的建立及顯著性分析。

1.響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案。Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.方差及顯著性檢驗(yàn)。用軟件Design-Expert.8.0.6進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、液料比及超聲時(shí)間四個(gè)因素對山藥皮中總黃酮提取率影響的回歸分析，分析結(jié)果見表3所示。對各個(gè)因素進(jìn)行擬合，獲得回歸方程：總黃酮提取率（%）=+0.40+0.013A-2.917E-003B+3.500E-003C-6.250E-003D-0.015AB-2.500E-003AC-0.028AD+1.250E-003BC+6.750E-003 BD-7.250E-003CD-0.064 A2-0.080B2-0.077C2-0.055D2

表3 回歸方程方差分析

注：**差異極顯著（p<0.01）;*差異顯著（p<0.05）

由表3可見，回歸方程方程分析顯著性檢驗(yàn)表明，該回歸模型顯著（p<0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.1669>0.05），表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；貧w方程中A、B、C、D的平方項(xiàng)p<0.01對響應(yīng)值的影響極顯著；一次項(xiàng)A和交互項(xiàng)AD對響應(yīng)值的影響顯著。各因素影響大小排序?yàn)锳>D>C>B即乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>液料比>超聲功率。

3.最佳工藝參數(shù)的確定。通過Design-Expert.8.0.6軟件對回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得出超聲輔助乙醇提取山藥皮中總黃酮的最佳工藝條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.26%，超聲功率298.33W，液料比50.24：1，超聲時(shí)間為24.54，在此條件下，山藥皮中總黃酮的提取率理論值為0.4000193%?？紤]到在實(shí)際中操作的可行性，將各工藝條件修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲功率300W，液料比為50：1，超聲時(shí)間為25min，在此條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得總黃酮提取率為0.399%，與理論預(yù)測值的相對誤差0.25%，再次驗(yàn)證該回歸模型具有一定有效性。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率的交互作用對提取率的影響

圖7 液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對提取率的影響

圖8 超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對提取率的影響

圖9 液料比與超聲功率的交互作用對提取率的影響

圖10 超聲時(shí)間與超聲功率的交互作用對提取率的影響

圖11 超聲時(shí)間與液料比的交互作用對提取率的影響

三、結(jié)論

采用超聲波輔助乙醇提取山藥皮中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲功率300W，液料比為50：1，超聲時(shí)間為25min，在此條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得總黃酮提取率為0.421%，為實(shí)現(xiàn)資源利用最大化，提高山藥本身經(jīng)濟(jì)價(jià)值，提供科學(xué)依據(jù)。