鈣蛋白酶1在瑞芬太尼誘發(fā)大鼠疼痛過(guò)敏中的作用

黃燕，周楠

（麗水市中心醫(yī)院 麻醉科，浙江 麗水 323000）

瑞芬太尼為芬太尼類μ型阿片受體激動(dòng)劑，由于其具有超短作用效應(yīng)，臨床上主要用于全麻誘導(dǎo)、全麻中維持鎮(zhèn)痛或輔助麻醉[1-2]。但臨床以及基礎(chǔ)研究均報(bào)道瑞芬太尼可誘發(fā)人或大鼠痛覺過(guò) 敏[3-4]。因此，研究瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過(guò)敏的信號(hào)機(jī)制，可為臨床預(yù)防或減輕痛覺過(guò)敏提供理論依據(jù)。研究顯示，痛覺過(guò)敏往往伴隨腺苷酸環(huán)化酶激活、cAMP生成增加以及鈣離子內(nèi)流[5]。鈣激活中性蛋白酶1（calcium-activated neutral protease，Calpain1或CANP1）是一種鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白酶，其激活狀態(tài)需要摩爾級(jí)別濃度的鈣離子，因此也被稱為μ-Calpain[6-7]。目前，CANP1與瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過(guò)敏間的關(guān)系鮮見報(bào)道。因此，本研究以瑞芬太尼誘導(dǎo)模型大鼠痛覺過(guò)敏，觀察CANP1在其中的作用，為臨床解決痛覺過(guò)敏提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：清潔級(jí)（SPF）成年雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量220～260 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。每籠4只飼養(yǎng)于排氣通風(fēng)籠具中，12 h光照，12 h黑暗，自由飲水?dāng)z食，溫度18～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.1.2 試劑：瑞芬太尼（湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司）；U0126和Calpeptin（美國(guó)Sigma Aldrich公司）；CAPN1抗體、ERK、p-ERK、GSK-3β、pGSK-3β抗 體、羊抗小鼠IgG-HRP抗體及羊抗兔IgG-HRP抗體（美國(guó)CST公司）；GAPDH抗體（美國(guó)Bioworld公司）；RIPA裂解液、BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 鞘內(nèi)和尾靜脈置管并篩選合格的大鼠：參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行尾靜脈和鞘內(nèi)置管。尾靜脈置 管：腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，在尾部中上l/3處以24號(hào)靜脈置管，倒吸注射器有回血為置管成功，固定留置針，應(yīng)用少量含肝素的0.9%氯化鈉溶液沖洗留置針。鞘內(nèi)置管：剪毛，消毒，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，切口并暴露L3-4間隙，逐層分離至黃韌帶，輕挑開硬脊膜，將PE-10導(dǎo)管向尾側(cè)插入2 cm，以少量含肝素的0.9%氯化鈉溶液沖洗留置針，消毒，縫皮，再消毒，60 W白熾燈20 cm照射1～2 h，清醒，單籠飼養(yǎng)。挑選無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙的大鼠于置管后2 d時(shí)鞘內(nèi)注射2%利多卡因 10 μL，注藥后30 s內(nèi)出現(xiàn)雙后肢麻痹的大鼠用于本研究。

1.2.2 建立切口痛模型大鼠：取置管合格的大鼠，參照文獻(xiàn)[9]方法建立切口痛模型。右后足以75%乙醇擦拭干凈，以手術(shù)刀從右后足足底后端約0.5 cm處向趾部做長(zhǎng)約1 cm的縱行切口，保持肌肉起止和附著完整的前提下用眼科鑷挑起足底肌肉并縱行分離至骨膜，縫合足底皮膚，術(shù)后傷口用碘伏消毒，并涂抹少量紅霉素軟膏預(yù)防感染。

1.2.3 分組：以尾靜脈和鞘內(nèi)置管合格的SD大鼠40只進(jìn)行分組給藥，設(shè)立對(duì)照組、瑞芬太尼組、瑞芬太尼+U0126組和瑞芬太尼+Calpeptin組，每組10只鼠。對(duì)照組鞘內(nèi)注射5%二甲基亞砜10 μL，30 min后尾靜脈輸注0.9%氯化鈉溶液0.1 mL·kg-1·min-1，輸注時(shí)間60 min；瑞芬太尼組鞘內(nèi)注射5%二甲基亞砜10 μL， 30 min后尾靜脈輸注瑞芬太尼1 μg·kg-1·min-1，持續(xù)時(shí)間60 min；瑞芬太尼+U0126組鞘內(nèi)以注射含 5 μg U0126的5%二甲基亞砜10 μL預(yù)處理30 min，尾靜脈輸注60 min瑞芬太尼1 μg·kg-1·min-1；瑞芬太尼+Calpeptin組鞘內(nèi)以注射含5 μg Calpeptin的5%二甲基亞砜10 μL預(yù)處理30 min，尾靜脈輸注60 min瑞芬太尼1 μg·kg-1·min-1。

1.2.4 機(jī)械縮足反應(yīng)閾（mechanical withdrawal threshold，MWT）和熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）檢測(cè)：分別于尾靜脈輸注前24 h（T0）、尾靜脈輸注后2 h（T1）、6 h（T2）、24 h（T3）和48 h（T4）時(shí)，在溫度為18～25 ℃的安靜環(huán)境中測(cè)定MWT和TWL。將大鼠置于15 cm×20 cm× 15 cm的金屬籠內(nèi)并適應(yīng)環(huán)境10 min，以von Frey 纖維絲垂直施加壓力，刺激右后足第二和第三趾骨間，模型大鼠出現(xiàn)快速縮足反應(yīng)、舔足或嘶叫時(shí)停止加壓，記錄此時(shí)壓力，每只大鼠測(cè)定3 次，間隔 10 min，3次均值即為本次MWT，其中為防止大鼠足底損傷，將最大壓力設(shè)為60 g。以熱板儀測(cè)定大鼠右后足TWL，大鼠右后足接觸熱板后出現(xiàn)縮足、踮足、嘶叫及舐足中的任一反應(yīng)時(shí)記錄時(shí)間，每只大鼠測(cè)定3次，間隔10 min，3次均值即為本次TWL，其中為防止大鼠燙傷，測(cè)試上限設(shè)為25 s。

1.2.5 Western blot檢測(cè)：檢測(cè)T4時(shí)模型大鼠MWT和TWL結(jié)束后處死動(dòng)物，取脊髓L4-6節(jié)段加入冰的組織蛋白裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制劑，使其終濃度為1 mmol·L-1），于均質(zhì)儀上勻漿，5.00 m/s 20 s，然后在4 ℃、20 627×g離心15 min。取樣品上清液留用，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量并制樣。進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，每個(gè)泳道按30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；然 后按要求加入CAPN1抗體（1:2 000）、ERK抗體（1: 2 000）、p-ERK抗體（1:1 000）、GSK-3β抗體（1:1 000）、pGSK-3β（1:1 000）室溫雜交1～2 h或4 ℃溫育過(guò)夜。一抗處理后，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1:4 000），室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，凝膠成像儀進(jìn)行成像，以Quantity One對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析，CANP1、GSK定量以內(nèi)參GAPDH校正，p-ERK以ERK校正，pGSK-3β以GSK-3β校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組T0～T4時(shí)間點(diǎn)MWT比較 與對(duì)照組比，T1～ T4瑞芬太尼組大鼠MWT均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與瑞芬太尼組比，T1～T4瑞芬太尼+ U0126組和瑞芬太尼+Calpeptin組MWT均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見圖1。

圖1 各組T0～T4時(shí)間點(diǎn)MWT比較

2.2 各組T0～T4時(shí)間點(diǎn)TWL比較 與對(duì)照組比，T1～ T4時(shí)間點(diǎn)瑞芬太尼組大鼠TWL均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與瑞芬太尼組比，T1～T4時(shí)間點(diǎn)瑞芬太尼+U0126組和瑞芬太尼+Calpeptin組各時(shí)間點(diǎn)TWL均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組T0～T4時(shí)間點(diǎn)TWL比較

2.3 各組CANP1和p-ERK蛋白表達(dá)比較 給藥后48 h 與對(duì)照組比，瑞芬太尼組大鼠p-ERK蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而與瑞芬太尼組比，瑞芬太尼+U0126組p-ERK蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對(duì)照組比，瑞芬太尼組Cleaved-CANP1明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而與瑞芬太尼組比，瑞芬太尼+U0126和 瑞芬太尼+Calpeptin組Cleaved-CANP1明顯減少，差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

2.4 各組動(dòng)物GSK-3β和pGSK-3β蛋白表達(dá)變化 給藥后48 h與對(duì)照組相比，瑞芬太尼組大鼠GSK-3β表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而與瑞芬太尼組比，瑞芬太尼+U0126組和瑞芬太尼+ Calpeptin組GSK-3β表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對(duì)照組比，瑞芬太尼大鼠pGSK-3β表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而與瑞芬太尼組比，瑞芬太尼+U0126組和瑞芬太尼+ Calpeptin組pGSK-3β表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

圖3 給藥后48 h各組CANP1和p-ERK蛋白表達(dá)變化

3 討論

痛覺過(guò)敏是指使用阿片類受體激動(dòng)藥物所引起的痛覺閾值降低，從而對(duì)疼痛敏感性增強(qiáng)的現(xiàn) 象[10]。瑞芬太尼是臨床手術(shù)麻醉常用的阿片類受體激動(dòng)藥物，可誘導(dǎo)痛覺過(guò)敏[3-4]。因此，防治痛覺過(guò)敏是減輕患者術(shù)后疼痛的關(guān)鍵。本研究以大鼠建立足部切口痛模型和尾靜脈注射瑞芬太尼，發(fā)現(xiàn)大鼠手術(shù)側(cè)足部MWT降低，TWL縮短，提示瑞芬太尼誘導(dǎo)了切口痛模型大鼠痛覺過(guò)敏。鞘內(nèi)注射U0126或Calpeptin預(yù)處理后顯著抑制了瑞芬太尼對(duì)模型鼠MWT和TWL的影響。U0126是MEK1/2的高效抑制劑，可抑制后者下游信號(hào)ERK1/2的活性[11]。而Calpeptin 為CANP廣譜抑制劑，能有效抑制CANP的活化[12]。提示，ERK1/2和CANP可能均參與了瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過(guò)敏。

圖4 給藥后48 h各組GSK-3β和pGSK-3β蛋白表達(dá)變化

為確證上述提示，本研究進(jìn)一步觀察了脊髓中ERK磷酸化水平以及CANP1蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯 示，瑞芬太尼組大鼠p-ERK表達(dá)顯著增加，CANP1（大亞基）蛋白自身水解表達(dá)增加，而U0126和Calpeptin 均能抑制上述效應(yīng)。研究報(bào)道瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠痛覺過(guò)敏與脊髓GSK-3β活性增強(qiáng)有關(guān)[13]。因此本研究同時(shí)觀察了GSK-3β在其中的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼組大鼠GSK-3β及pGSK-3β表達(dá)均顯著增強(qiáng)，U0126和Calpeptin預(yù)處理可阻斷上述效應(yīng)。這些提示瑞芬太尼可能通過(guò)ERK的磷酸化和CANP1的蛋白水解上調(diào)GSK-3β并促進(jìn)GSK-3β磷酸化水平從而誘導(dǎo)模型大鼠痛覺過(guò)敏。研究顯示ERK為CANP1的上游信號(hào)靶點(diǎn)，參與CANP1的活化[14]。綜上提示，瑞芬太尼誘導(dǎo)大鼠疼痛過(guò)敏與激活ERK/CANP1/GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)。干預(yù)ERK/CANP1/GSK-3β信號(hào)激活可能是防治瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過(guò)敏的方法之一，但本研究為基礎(chǔ)研究，還有待于進(jìn)一步臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。