傷科消腫止痛膏制備工藝以及有效成分含量測(cè)定

章洪，王蕭楓，黃淑嫻

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.藥劑科；2.骨科）

傷科消腫止痛膏為溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院傳統(tǒng)的傷科外用藥，由大血藤、雞血藤、紅木香等7味中草藥組成，是老一輩骨傷名家在民間秘方基礎(chǔ)上的集體經(jīng)驗(yàn)結(jié)晶[1]，至今已有40 多年的使用歷史，臨床療效顯著[2]，尤其是對(duì)各種筋傷有顯著的消腫止痛功效，在溫州乃至浙南地區(qū)享負(fù)盛名。研究表明，傷科消腫止痛膏對(duì)急性軟組織損傷有確切的療效[2]，其抗炎鎮(zhèn)痛的作用明顯優(yōu)于傷科靈[3]，其活血化瘀消腫方面優(yōu)于扶他林軟膏[4-5]。然而其工藝粗糙，制備周期長(zhǎng)，難以對(duì)藥效成分和主要成分進(jìn)行有效的質(zhì)控。本研究采用正交法對(duì)影響中藥提取的4個(gè)因素進(jìn)行考察，采用單因素考察法選取合適輔料，并采用HPLC法測(cè)定虎杖苷和大黃素的含量。

1 材料和方法

1.1 儀器 Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；Agilent 1200型高效液相色譜儀，配制四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、DAD檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DTY-10A智能恒溫循環(huán)器（北京德天佑科技發(fā)展有限公司）；101-AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZF6050AB真空干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；JCS-600電子天平（金華凱豐集團(tuán)有限公司）；CP214電子天平（美國(guó)奧豪斯儀器有限公司）；S10-3型恒溫磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)DS170309-038，純度98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司），大黃素對(duì)照品（批號(hào)DST161212-030，純度98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司），明膠（批號(hào)2091044，江門羅賽洛明膠有限公司），阿拉伯膠（批號(hào)170301，鄂州葛店人福藥用輔料有限公司），甘油（批號(hào)20170801，南昌白云藥業(yè)有限公司），苯甲酸鈉（批號(hào)20170309，長(zhǎng)沙華日制藥有限公司），月桂氮卓酮（批號(hào)170202，天門科捷制藥有限公司），乙腈、甲醇（色譜純）；其他試劑均為分析純。雞血藤（批號(hào)161201，產(chǎn)地浙江）、大血藤（批號(hào)170101，產(chǎn)地浙江）、紅木香（批號(hào)160920，產(chǎn)地云南）、虎杖（批號(hào)161101，產(chǎn)地浙江）、梔子根（批號(hào)160901，產(chǎn)地浙江）購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司；生川烏（批號(hào)160719，產(chǎn)地四川）、生草烏（批號(hào)160701，產(chǎn)地浙江）購(gòu)自杭州華東中藥飲片有限公司；飲片均由溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。

1.3 提取工藝

1.3.1 醇提工藝：取雞血藤、大血藤、虎杖、梔子根和紅木香五味藥，在進(jìn)行了單因素考察的前提下，采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，以溶劑用量（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）、提取次數(shù)（D）為影響因素，選用虎杖苷、大黃素和干膏的得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，進(jìn)行條件優(yōu)選，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 L9(34)因素水平表

1.3.2 水提工藝：取生川烏和生草烏適量，加入7倍量的水，提取2次，每次2 h，合并提取液，過(guò)濾，濃縮至相對(duì)密度1.03（50 ℃），備用。將醇提液與水提液混合，即得傷科消腫止痛膏提取液。

1.4 制備工藝

1.4.1 制備：取明膠和阿拉伯膠加入傷科消腫止痛膏提取液適量，水浴60 ℃溶解，攪拌均勻，再加入苯甲酸鈉和甘油適量，攪拌均勻，當(dāng)水浴溫度降至40 ℃時(shí)，加入氮酮，攪拌均勻，涂布在無(wú)紡布上，待其冷卻凝固即得傷科消腫止痛膏。

1.4.2 單因素考察：采用單因素考察法，分別考察明膠與阿拉伯膠的比例（1:1、4:1、1:4）和傷科消腫止痛膏提取液的加入量（10、15、20 mL）。

1.5 含量測(cè)定

1.5.1 色譜條件：大黃素采用色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.1%磷酸水溶液-甲醇（20:80）；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

虎杖苷采用色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，15% B；10～30 min，15%～30% B）；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

1.5.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取大黃素對(duì)照品適量，加甲醇定容，即得大黃素對(duì)照品溶液。精密稱取虎杖苷對(duì)照品適量，加稀乙醇定容，即得虎杖苷對(duì)照品溶液。

1.5.3 供試品溶液的制備：取傷科消腫止痛膏適量，去除無(wú)紡布，精密稱定，精密加入三氯甲烷 25 mL和2.5 mol·L-1硫酸溶液20 mL，稱量，置80 ℃ 水浴中加熱回流2 h，冷卻至室溫，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失重量，搖勻。分取三氯甲烷液，精密量取10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得大黃素供試品溶液。

取傷科消腫止痛膏適量，去除無(wú)紡布，精密稱定，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流 30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，取上清液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得虎杖苷供試品溶液。

1.5.4 陰性溶液的制備：按提取工藝和制備工藝制備不含虎杖的傷科消腫止痛膏，按供試品溶液制備方法分別制備大黃素陰性溶液和虎杖苷陰性溶液。

1.5.5 專屬性考察：吸取對(duì)照品溶液、供試品溶 液、陰性溶液適量，運(yùn)用本研究色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.5.6 線性關(guān)系考察：精密吸取虎杖苷和大黃素對(duì)照品溶液適量，稀釋成一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液（虎杖苷：0.006、0.020、0.059、0.178、0.533、1.600 mg·mL-1；大黃素：0.014、0.041、0.123、 0.370、0.740 mg·mL-1）。運(yùn)用本研究色譜條件對(duì)虎杖苷和大黃素進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.7 精密度試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，運(yùn)用本文色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。

1.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，運(yùn)用本文色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

1.5.9 重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取同一批供試品溶液，6份，運(yùn)用本研究色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

1.5.10 加樣回收試驗(yàn)：取傷科消腫止痛膏適量12份，去除無(wú)紡布，精密稱定，分別加入大黃素和虎杖苷對(duì)照品適量，按1.5.3 項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

2 結(jié)果

2.1 提取工藝 按處方量稱取各藥材適量，按正交設(shè)計(jì)表所列條件回流提取，測(cè)定虎杖苷和大黃素的得率以及干膏得率，并計(jì)算。結(jié)果=干膏得率/最大干膏得率×20+虎杖苷得率/最大虎杖苷得率×40+大黃素得率/最大大黃素得率×40。

直觀分析IA＞IIA＞IIIA，IIIB＞IIB＞IB，IIC＞ IC＞IIIC，IIID＞IID＞ID，RD＞RC＞RB＞RA。方差分析 A為誤差項(xiàng)，B、C、D對(duì)指標(biāo)的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2-3。所以最佳醇提工藝為D3C2B3A1，考慮到節(jié)約時(shí)間和成本，故最終最佳醇提工藝為 D3C2B2A1，即7倍體積的70%乙醇溶液，提取3次，每次2 h。

確定提取工藝為：雞血藤等五味藥用7倍體積的70%乙醇溶液，提取3次，每次2 h，合并提取液，過(guò)濾，回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.03（50 ℃）；生川烏和生草烏用7倍量的水，提取2次，每次2 h，合并提取液，過(guò)濾，濃縮至相對(duì)密度1.03（50 ℃）。合并醇提液與水提液即得傷科消腫止痛膏提取液。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.2 制備工藝 由表4可知，明膠與阿拉伯膠的比例為1:4，兩者質(zhì)量總和與傷科消腫止痛膏提取液的比例為1:3時(shí)，所得膏體內(nèi)外黏度適中。

確定制備工藝為以1:4的比例取明膠和阿拉伯膠適量，混合均勻，加入3倍量傷科消腫止痛膏提取液，水浴60 ℃溶解，攪拌均勻，再加入苯甲酸鈉和甘油適量，攪拌均勻，當(dāng)水浴溫度降至40 ℃時(shí)，加入氮酮適量，攪拌均勻，涂布在無(wú)紡布上，待其冷卻凝固即得傷科消腫止痛膏。

表4 制備工藝

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 專屬性考察：在本研究色譜條件下，2種成分均能基線分離，供試品中虎杖苷和大黃素的保留時(shí)間與對(duì)照品中色譜峰的保留時(shí)間相符，在陰性溶液中均無(wú)干擾峰（見(jiàn)圖1-2）。

2.3.2 線性范圍：以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程：虎杖苷Y=20164X- 39.865（r=0.9999），在0.006～1.600 mg·mL-1線性關(guān)系良好；大黃素Y=20394X-4.5931（r=0.9996），在0.014～0.740 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收實(shí)驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次，虎杖苷的RSD為0.870%，大黃素的RSD為0.851%，表明儀器精密度良好。室溫下放置24 h，虎杖苷的RSD為0.786%，大黃素的RSD為0.719%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。同一批樣品進(jìn)樣檢測(cè)，虎杖苷的RSD為2.154%，大黃素的RSD為2.811%，表明本方法重復(fù)性良好。虎杖苷和大黃素加樣回收率在（100±5）%以內(nèi)，符合要求，見(jiàn)表5。

2.3.4 工藝驗(yàn)證：按處方配比取各藥材共650 g，按提取工藝和制備工藝制備傷科消腫止痛膏3批，虎 杖苷的得率分別是2.30%、2.34%、2.20%，RSD值為3.085%；大黃素的得率分別是0.72%、0.86%、0.76%，RSD值為9.415%；平均每克含虎杖苷12.71 μg，含大黃素4.14 μg。符合要求，該工藝可用于大批量制備。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇 處方中虎杖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完整，其主要藥效成分大黃素和虎杖苷均有完整的定性定量檢測(cè)手段[7-8]。大黃素具有抑菌抗炎及免疫調(diào)節(jié)抗氧化等作用，對(duì)多種血管有舒張作用，能改善微循環(huán)，抑制血小板聚集，降低血液黏度[9-10]；虎杖苷具有抗菌抗病毒抗炎抗過(guò)敏的作用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性有著重要作用，從而維持血管通透性、免疫防御以及炎癥反應(yīng)[11-12]。研究之初，也考慮過(guò)紅景天苷和芒柄花素作為檢測(cè)成分，但在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，紅景天苷難以有效分離，芒柄花素含量太低，故舍棄，最終選擇大黃素和虎杖苷作為指標(biāo)成分。

圖1 虎杖苷高效液相色譜圖

圖2 大黃素高效液相色譜圖

表5 加樣回收率

干膏是中藥提取物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，干膏的得率的大小對(duì)有效成分的得率和制劑臨床療效有著一定的影響，在醇提工藝的正交試驗(yàn)中，確定干膏得率、大黃素得率、虎杖苷得率的權(quán)重系數(shù)為20:40:40。實(shí)驗(yàn)以2個(gè)藥效成分和干膏得率為指標(biāo)成分對(duì)醇提工藝進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，符合中藥復(fù)方的整體觀。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)水平選擇 實(shí)驗(yàn)之初，采用單因素法分別考察了乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)藥效成分得率的影響，研究發(fā)現(xiàn)，70%乙醇對(duì)2種藥效成分都具有較好的提取效果，故選擇50%、70%、90%作為乙醇 濃度的3個(gè)水平。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)3次提取，大黃素已難以檢測(cè)，虎杖苷峰面積下降了14倍，可忽略不計(jì)，故選擇1次、2次、3次作為提取次數(shù)的3個(gè)水 平。

3.3 大黃素轉(zhuǎn)移率 按藥典方法測(cè)定同批次虎杖藥材中大黃素的含量為20.4%，五味藥材合煎后，大黃素的得率僅0.611%，轉(zhuǎn)移率僅3.00%，說(shuō)明在提取過(guò)程中大部分大黃素轉(zhuǎn)化為其他成分，具體轉(zhuǎn)化為何種成分，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

本研究建立的傷科消腫止痛膏制備工藝，操作簡(jiǎn)單，過(guò)程可控，對(duì)提高傷科消腫止痛膏藥效的穩(wěn)定性有一定的作用，可用于大批量生產(chǎn)。