炎癥通路在強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病中作用的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

李辰璐，方錦霞，羅京，朱小春，王曉冰

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，浙江 溫州 325015）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種主要累及脊柱、骶髂關(guān)節(jié)等中軸關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)等外周關(guān)節(jié)的慢性炎癥性疾病。其主要的病理改變是附著點(diǎn)炎，嚴(yán)重者會出現(xiàn)骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞，甚至關(guān)節(jié)融合強(qiáng)直，對患者的生活帶來嚴(yán)重的危害。在全球范圍，AS的發(fā)病率為1.0%～1.4%[1]，與遺傳背景密切相關(guān)。

AS的易感等位基因人類白細(xì)胞抗原B27（human leukocyte antigen B27，HLA-B27）的陽性率分布與全球的發(fā)病率分布相一致[2]，它是迄今為止已知的復(fù)雜疾病中相關(guān)性最強(qiáng)的一個等位基因[3]。此外，全基因組研究發(fā)現(xiàn)某些非HLA易感基因在AS的發(fā)展中起重要作用[4]。轉(zhuǎn)錄組是由基因組轉(zhuǎn)錄的一系列RNA分子組成，包括mRNA、tRNA、rRNA和其他的調(diào)節(jié)非編碼RNAs。與基因組不同，轉(zhuǎn)錄組是動態(tài)的，伴隨著個體的生命進(jìn)程不停地變化進(jìn)展，而且還會針對環(huán)境刺激和內(nèi)部生物信號做出快速的反應(yīng)。這些基因的差異表達(dá)和調(diào)節(jié)是真核生物細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，擴(kuò)展了靜態(tài)的基因組的視野，使機(jī)體內(nèi)不同類型的細(xì)胞能表達(dá)出完全不同的功能[5]。在人類疾病的研究中，比較基因表達(dá)的分析為疾病的遺傳學(xué)研究提供了的重要信息。通過上調(diào)或者下調(diào)它們的表達(dá)成分即能決定有無患病群體的表型差異。

對AS患者血標(biāo)本的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)炎癥作用基因以及調(diào)節(jié)軟骨和骨代謝的候選基因[6]。來自Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫的分析證明了AS患者較對照者高表達(dá)的差異基因主要富集在抗原加工和抗原提呈，細(xì)胞因子受體相互作用、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等通路[7-8]。根據(jù)現(xiàn)有研究，除ERAP1、IL23R和RUNX3的少數(shù)基因確認(rèn)與AS發(fā)病過程相關(guān)，還需要更進(jìn)一步的研究來確認(rèn)這些通路在疾病過程中的參與以及發(fā)掘更多相關(guān)基因[9]。然而，不同地域和人種的遺傳背景具有多樣性[10]。AS之前的轉(zhuǎn)錄組研究大多針對非漢族人群。本研究旨在通過探討漢族人群AS患者與正常人轉(zhuǎn)錄組差異，分析AS發(fā)病機(jī)制，為治療AS尋找新的靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2017年住院的53例AS患者作為病例組，其中男46例，女7例。同期健康體檢者53例為對照組，男46例，女7例。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：18～70歲且有＞3個月的炎性腰背痛，符合1984年紐約分類標(biāo)準(zhǔn)[11]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他免疫系統(tǒng)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病性關(guān)節(jié)炎，合并重要臟器功能不全，合并慢性感染性疾病（包括乙型病毒性肝炎、結(jié)核）、腫瘤、心腦血管疾病、精神障礙等。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受檢者簽署知情同意書。每位受檢者抽取外周血5 mL，加入PBS與淋巴細(xì)胞分離液后離心取白膜層，洗滌獲得外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monocytes，PBMCs）。將從PBMCs樣品中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在 Illumina平臺上測序。

1.2 差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEGs）篩選 使用DEseq2（18）軟件包對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并進(jìn)行二維主成分分析（principal component analysis，PCA）和層次聚 類，以顯示病例組和對照組之間的相似性和差異。使用DEseq2進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，如果基因符合以下標(biāo)準(zhǔn)，則該基因被認(rèn)為是DEGs：DEseq2中的錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05和log2倍變化（FC）＜-1或log2 FC＞1。使用ggplot2軟件包在R軟件中構(gòu)建可視化不同對象之間所有DEG的火山圖，并使用R軟件包pheatmap繪制DEG的熱圖。

1.3 差異表達(dá)基因的GO（gene ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析 采用ClueGo插件[12]在Cystoscape[13]中整合了GO術(shù)語，并分別創(chuàng)建了具有上調(diào)基因的生物過程 網(wǎng)絡(luò)。采用Bonferroni法進(jìn)行校正，P閾值為0.05。信號通路分析在Kobas3.0[14]的在線網(wǎng)站（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn）上進(jìn)行，包括KEGG途徑、Reactome、BioCyc和PANTHER信號通路分析，并使用GOplot繪圖。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析（protein-protein interaction，PPI） DEGs的PPI數(shù)據(jù)是從用于檢索相互作用基因的搜索工具（STRING）版本11.0（https://www.string-db.org/）[15]下載的數(shù)據(jù)。然后，通過Cytoscape軟件建立并可視化PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用插件MCODE[16]確定DEG的相互關(guān)聯(lián)程度。

1.5 細(xì)胞因子分析 本試驗(yàn)另外入選了30例AS患者及30位健康對照。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)同前。所有受檢者簽署知情同意書后抽取外周血5 mL，提取血漿。ELISA法測定患者外周血漿中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用Rv3.6.1 for Linux軟件DEseq2、ggpubr統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。差異基因分析使用Wald檢驗(yàn)。2組間細(xì)胞因子比較使用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS患者與對照組的基因表達(dá)模式差異 使用DEseq2對比AS研究組與對照組基因表達(dá)差異，基于標(biāo)準(zhǔn)（P＜0.05 and |logFC|＞1），找到153個DEGs，其中149個基因上調(diào)，4個基因下調(diào)（見圖1）。表明除HLA-B27以外，還有一系列的基因參與了AS的發(fā)病。其中部分基因在既往的文獻(xiàn)報道中提及與AS相關(guān)，如THBD[17]、IL1B[18]、CXCL8[19]、CCL7[20]等。提取基因表達(dá)值，繪制層次聚類熱圖以顯示所有的差異DEGs，可以看到2組的基因表達(dá)譜存在明顯的差異，見圖2。

圖1 AS中所有DEGs火山圖

圖2 AS組和對照組DEGs熱圖

2.2 AS組與對照組的DEGs涉及的信號通路 對發(fā)現(xiàn)的DEGs進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)了幾條重要的信號通路，包括細(xì)胞因子間相互作用、TNF信號通路A/1（視紫紅質(zhì)樣受體）、GPCR配體結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、CCKR信號圖、血液凝固、趨化因子介導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞因子信號通路等，見圖3。

圖3 DEGs通路圖

2.3 AS組與對照組的DEGs編碼蛋白的相互關(guān)系 對涉及KEGG途徑的DEGs進(jìn)行了PPI分析。在由STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，大多數(shù)基因，包括CXCL8、IL1B、CXCL1、CCL2、PTGS2、EDN1 和 SERPINE1，與KEGG途徑中涉及的其他DEGs相互作用（見圖4），表明這些基因可能通過相互作用參與AS的發(fā)病。

圖4 通過STRING完成的DEGs的PPI圖

2.4 AS組與對照組的DEGs的生物功能注釋 DEGs在生物學(xué)過程（BP）中顯著富集，包括粒細(xì)胞遷移（GO：0097530），中性粒細(xì)胞遷移（GO：1990266），發(fā)熱過程（GO：0001660）等，這些都起著重要的作用。此外，DEGs在分子功能組（MF）中顯著富集趨化因子受體結(jié)合（GO：0042379）、趨化因子活性（GO：0008009）和過氧化物酶活性（GO：0004601）?？傊珿O分析的結(jié)果表明，大多數(shù)DEGs在粒細(xì)胞遷移、中性粒細(xì)胞遷移、發(fā)熱過程、趨化因子活性等相關(guān)，所有這些都可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。見圖5。

2.5 炎性細(xì)胞因子差異 為進(jìn)一步驗(yàn)證這些炎癥相關(guān)基因?qū)S的作用，對外周血的重要炎癥因子進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)AS組較對照組在IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等外周血炎性細(xì)胞因子水平上升（P＜0.05），IL-4因子水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖5 DEGs的ClueGo網(wǎng)絡(luò)分析圖

圖6 2組細(xì)胞因子相對表達(dá)量（每組n=30）

3 討論

RNA是基因和蛋白之間的關(guān)鍵鏈接，所以轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)締組織疾病的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)研究。本項(xiàng)目通過高通量的RNA測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)AS患者和健康對照者存在153個DEGs，其中149個基因上調(diào)。而這些基因相互之間密切聯(lián)系，相互作用，共同參與疾病的發(fā)生。生物功能分析提示這些差異基因主要聚集在TNF信號通路、趨化因子信號傳導(dǎo)等炎癥相關(guān)通路。而這個結(jié)果又進(jìn)一步在外周血中的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平得到驗(yàn)證。

已有研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞分化、INF信號傳導(dǎo)途徑和與這2種信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的基因，特別是 FCGR2B、STAT2、SOCS3、IFIT1 和IFIT3，可能在AS的發(fā)病中發(fā)揮作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)了大量與TNF信號通路相關(guān)的基因，如CXCL3、IL1B、CCL20、CXCL2、 CXCL1、SOCS3、PTGS2 等。已有研究證實(shí)TNF信號通路在AS發(fā)病過程中的重要作用，而對TNF-α的特異性抑制劑，也已在臨床上大量使用于AS患者的治療，并取得良好的療效[22]。因此，本研究也為中國漢族人群應(yīng)用該生物制劑提供了一定的理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)在AS患者的外周血細(xì)胞中趨化因子/趨化因子受體家族的炎癥因子表達(dá)顯著上調(diào)，包括CCL7、CXCL3、CXCL8、CCL2、CCL20、CXCL2、CXCL1。我們對DEGs進(jìn)行通路分析也發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的基因集中在趨化因子介導(dǎo)的炎癥及趨化因子與趨化因子受體結(jié)合等通路。生物學(xué)功能分析也提示這些基因在粒細(xì)胞遷移中的作用。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)趨化因子的定向趨化作用控制著各種免疫細(xì)胞到達(dá)感染、創(chuàng)傷和異常增殖部位，從而發(fā)揮特定的免疫功能[23]。所有這些都支持AS疾病過程中免疫炎癥的過度活化，也進(jìn)一步支持AS是一種兼具有炎癥和免疫特色的系統(tǒng)性疾病。

臨床病例的外周血檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α炎癥相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞因子在AS中表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了測序結(jié)果。文獻(xiàn)報道IL-2、IL-6、TNF-α[24-25]等細(xì)胞因子在AS疾病的病理過程中發(fā)揮作用，跟我們的研究結(jié)果相符。因此，這些細(xì)胞因子也成為AS治療的靶點(diǎn)，也為細(xì)胞因子的生物制劑治療AS提供理論依據(jù)。

本研究的不足是進(jìn)行RNA測序的樣本數(shù)相對較少，尚未考慮患者的個體差異和疾病的特質(zhì)性，仍需要大樣本的研究以更加全面可靠地證實(shí)本研究的結(jié)果。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)的許多可能參與AS疾病過程的DEGs，尚無法確定其具體作用機(jī)制，仍需要進(jìn)一步通過細(xì)胞和（或）動物模型進(jìn)一步探索。

總之，本研究通過對AS和正常人轉(zhuǎn)錄組的研究，發(fā)現(xiàn)了炎癥相關(guān)基因在AS患者中明顯表達(dá)上調(diào)，提示這些基因可能參與AS的發(fā)病過程。這些基因主要涉及到TNF信號通路、趨化因子/趨化因子受體等炎癥相關(guān)的重要組成成分和通路。這些信號通路及炎癥因子可成為未來AS診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。