阿希蕉合生花組培快繁技術(shù)研究

黃東梅 許奕 李敬陽 李羽佳 林妃 李艷霞 宋順

摘 ?要 ?阿希蕉為野生香蕉資源，可作為重要的遺傳育種資源并具有觀賞價值。本研究以阿希蕉合生花為植物材料，進行組培快繁技術(shù)研究。結(jié)果表明，阿希蕉在巴西蕉愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出愈傷組織，最佳芽分化培養(yǎng)基配方為MS+6-BA（3.0 mg/L）+NAA（0.1～0.2 mg/L），最佳芽增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA（2.0 mg/L）+NAA（0.1 mg/L），最佳生根培養(yǎng)基配方為MS+IBA（3.0 mg/L）+NAA（0.3 mg/L）。從取材到獲得根系完整的組培苗約需100 d，繁殖效率100株/花苞以上，增殖效率高，可達到快速繁育的目的。

關(guān)鍵詞 ?阿希蕉;合生花;組培;芽分化;芽增殖

中圖分類號 ?S686 ? ? ?文獻標識碼 ?A

Abstract ?As a wild banana resource， Musa velutina can be regarded as an important genetic and breeding resource and has an ornamental value. In this study， the tissue culture and rapid propagation technology of Musa velutina were studied using the hopson flowers as the plant materials. Callus could be induced by the callus induction medium. The best bud differentiation medium was MS+6-BA （3.0 mg/L）+NAA （0.10.2 mg/L）， the best bud proliferation medium was MS+6-BA （2.0 mg/L）+NAA （0.1 mg/L）， and the best rooting medium was MS+IBA （3.0 mg/L）+NAA （0.3 mg/L）. It took about 100 d from sampling to obtaining tissue culture seedlings with complete root system， and the reproduction efficiency was more than 100 plants/flower bud.

Keywords ?Musa velutina; hopson flowers; tissue culture; bud differentiation; bud proliferation

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.11.011

阿希蕉（Musa velutina），又名朝天蕉，是姜目芭蕉科芭蕉屬的植物。關(guān)于阿希蕉的拉丁文名，有些國內(nèi)的報道認為是Musa rubra Wall. ex Kurz，但綜合國外多個文獻對Musa rubra及Musa velutina植株形態(tài)的描述，阿希蕉的阿拉丁文名應(yīng)該為Musa velutina[1-4]。芭蕉屬（Musa）植物一般分為5個組：分別Eumusa（2n=22）、Rhodochlamys（2n=22）、Callimusa（2n=20）、Australimusa（2n=20）、Ingentimusa（2n=14或18）[5]。Rhodochlamys組植物的特征是花序直立或下垂，果序直立指向花序頂端，具有觀賞價值[6]，Rhodochlamys分布區(qū)域有限，僅在印度-老撾、柬埔寨-中國一帶[7]，阿希蕉屬于Rhodochlamys一類，起源于印度阿薩姆的亞熱帶常綠森林，分布于印度、緬甸、泰國等地，多生長在陰濕溝谷底和半沼澤地[8]。阿希蕉假莖細且矮，約高1.1～1.6 m，葉片間生長緊湊，花序直立或上舉，花苞色紅鮮艷，果序亦為直立狀，果實小巧飽滿，呈紫紅色，果內(nèi)有不規(guī)則多棱形種子[9]。

目前關(guān)于阿希蕉的研究報告大多集中在資源收集、利用、分類和形態(tài)描述[10-13]。雖然野生香蕉大多有種子，但是大多野生香蕉種子發(fā)芽率很低，不能形成長期穩(wěn)定的大群落或只能形成小群落，甚至不能在自然環(huán)境里形成群落，只能零星生長幾株[14]，因此很難依靠阿希蕉種子進行大面積繁殖，目前也尚無人工繁育或組織培養(yǎng)的報道。隨著熱區(qū)種植業(yè)的發(fā)展，珍貴的野香蕉資源已經(jīng)日益稀少，甚至瀕臨滅絕。阿希蕉作為野生資源，一方面可用作遺傳育種材料[15]，另一方面其花序直立苞片鮮艷，果實沖天長出色呈紫紅，具有觀賞價值[16]，可進一步開發(fā)和推廣。本研究擬以阿希蕉合生花為植物材料，進行愈傷組織誘導(dǎo)及組培快繁技術(shù)研究，以期為阿希蕉的資源利用、繁育和推廣打下基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

選取瓊海東紅農(nóng)場和定安黃竹一帶野外生長的阿希蕉斷蕾期合生花為植物材料。

1.2 ?方法

1.2.1 ?外植體消毒 ?首先將大的花苞片逐個剝除至剩余花苞長度為9～10 cm時，在超凈工作臺前用75%酒精噴灑表面進行消毒后，轉(zhuǎn)入超凈工作臺，用尖嘴鑷子繼續(xù)剝除花苞片，至花苞長度為2 cm左右，將花苞片橫切成厚度均一的薄片（約1～2 mm），用手術(shù)刀輕輕將薄片轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 ?愈傷組織誘導(dǎo) ?愈傷組織培養(yǎng)基參考張建斌等[17]在巴西蕉未成熟雄花組培快繁的配方：MS+TDZ（0.2 mg/L）+ZT（0.2 mg/L）+生物素（1.0 mg/L）+谷氨酰胺（100 mg/L）+糖（40 g/L）。26 ℃黑暗條件培養(yǎng)，每2周繼代一次。

1.2.3 ?芽分化培養(yǎng) ?待愈傷組織誘導(dǎo)完成后，將愈傷組織分成均一小塊，轉(zhuǎn)移至芽分化培養(yǎng)基上。為了研究不同激素濃度對芽分化的影響，選用6-BA和NAA，設(shè)立不同的濃度梯度，6-BA設(shè)1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，4個處理;NAA設(shè)0.1、0.2 mg/L，2個處理，共8個處理組合。26 ℃光周期16 h/8 h（光/暗）培養(yǎng)，每2周繼代一次，待長出多芽體后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4 ?芽增殖培養(yǎng) ?將多芽體切割成均一的小塊芽并轉(zhuǎn)移至芽增殖培養(yǎng)基上。為了研究不同激素濃度對芽增殖的影響，選用6-BA和NAA，設(shè)立不同的濃度梯度，6-BA設(shè)1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，4個處理;NAA設(shè)0.1、0.2 mg/L，2個處理，共8個處理組合。26 ℃光周期16 h/8 h（光/暗）培養(yǎng)，每2周繼代一次，待多芽體上的長出較多的不定芽且長至2～3 cm后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.5 ?生根誘導(dǎo)培養(yǎng) ?不定芽經(jīng)過芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)長至2～3 cm后，將不定芽切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基選用IBA和NAA，設(shè)立不同的濃度梯度，IBA設(shè)2.0、3.0、4.0 mg/L，3個處理;NAA設(shè)計0.1、0.3、0.5 mg/L，3個處理，共9個處理組合。28 ℃光周期16 h/8 h（光/暗）培養(yǎng)，待根系長出并伸長后統(tǒng)計結(jié)果。

待長成健壯的生根苗后，將培養(yǎng)瓶打開瓶蓋，放置于溫室煉苗1周左右，取出生根苗用自來水清洗去掉根系上所黏附的培養(yǎng)基，栽入含有50%椰糠的基質(zhì)中，用保鮮膜覆蓋，每天定期噴水保濕，約1周后去掉保鮮膜進行正常栽培管理。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?愈傷組織誘導(dǎo)情況

花苞薄切片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，約1周左右開始膨大，由白色薄切片轉(zhuǎn)成黑褐色，然后逐漸長出白色的細小愈傷，隨著培養(yǎng)時間增加愈傷組織增多顏色由白色轉(zhuǎn)成白綠色，30 d左右長出的結(jié)構(gòu)緊密愈傷組織可轉(zhuǎn)入下一步的芽分化培養(yǎng)。除了極個別污染和褐化壞死，愈傷組織誘導(dǎo)率較高，達到90%。

2.2 ?不同激素組合對芽分化的影響

將誘導(dǎo)出的愈傷組織切成均一小塊，接種到8種芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，約30 d左右陸續(xù)分化出芽點，形成多芽體狀態(tài)（圖1A）。觀察發(fā)現(xiàn)阿希蕉芽分化于培養(yǎng)基上面部分的新芽點較密集且小，而培養(yǎng)基下面部分的芽少且長較大。8個處理出芽結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)7號培養(yǎng)基芽分化誘導(dǎo)率最高，同時3號培養(yǎng)基與7號培養(yǎng)基的芽分化誘導(dǎo)率無顯著差異，其他配方培養(yǎng)基與7號培養(yǎng)基芽分化誘導(dǎo)率差異顯著。根據(jù)結(jié)果得出最優(yōu)化的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+6-BA（3.0 mg/L）+NAA（0.1～0.2 mg/L）。

2.3 ?不同激素組合對芽增殖的影響

將多芽體轉(zhuǎn)至芽增殖培養(yǎng)基上，芽點逐漸增多，變綠變粗并伸長成不定芽（圖1B），統(tǒng)計結(jié)果表明，不同的細胞分裂素和生長素配比對芽增殖有影響，8個處理組合的芽增殖系數(shù)在5%～30%之間，差異較大。其中3號、4號和8號培養(yǎng)基的增殖系數(shù)較低，多芽體在培養(yǎng)基上隨著培養(yǎng)時間的增加多芽體增大但多為白色蓬松狀且漸趨玻璃化，芽點難以變綠和伸長，不定芽數(shù)少;2號、7號培養(yǎng)基的增殖系數(shù)較高，不定芽數(shù)多，且生長粗壯，其中2號培養(yǎng)基MS+6-BA（2.0 mg/L）+ NAA（0.1 mg/L）為最優(yōu)化增殖培養(yǎng)基。

2.4 ?不同激素組合對生根誘導(dǎo)的影響

將不定芽接種到不同生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，約10 d左右基部開始膨大，并逐漸長出凸起狀的根原基，隨著培養(yǎng)時間的推進，繼而長出白色根并逐漸伸長，約40 d左右可長出較長的根系（圖1C），生根率均較高，達到86%以上，其中以培養(yǎng)基MS+IBA（3.0 mg/L）+NAA（0.3 mg/L）生根效果最好，其根原基誘導(dǎo)較早，且生根及根毛生長較快，生根誘導(dǎo)率100%，平均每株大約可長出5～6條根。將根系良好的生根苗進行煉苗并移栽至基質(zhì)，進行良好的水肥護理，成活率可達95%以上。

3 ?討論

阿希蕉的種子直接萌發(fā)具有延遲和間歇性，萌發(fā)耗時9個月，萌發(fā)率為78%[18]，因此靠常規(guī)的播種繁育效率較低。組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用可以突破種子萌發(fā)效率低的瓶頸。將阿希蕉合生花薄切片在已報道的巴西蕉愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出愈傷組織，并能進一步分化出不定芽。在愈傷組織分化出不定芽階段，已報道的巴西蕉最佳胚性分化培養(yǎng)基為MS+6-BA（4.0 mg/L）+ NAA（0.3 mg/L），而在本研究阿希蕉芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選中得出的最優(yōu)化培養(yǎng)基為MS+ 6-BA（3.0 mg/L）+NAA（0.1～0.2 mg/L），過高的激素濃度不適宜阿希蕉的芽分化誘導(dǎo)。分化出多芽體后，隨著培養(yǎng)時間的增加，多芽體會逐漸增大但多為白色蓬松狀且漸趨玻璃化，芽點難以變綠和伸長，因此需要在芽分化誘導(dǎo)后還需要增加芽增殖誘導(dǎo)步驟，對芽增殖培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化篩選，最優(yōu)化的配方為MS+6-BA（2.0 mg/L）+ NAA（0.1 mg/L）。芽分化培養(yǎng)中的激素濃度較芽增殖培養(yǎng)基中的高，表明在芽誘導(dǎo)前期需要高濃度的激素來觸發(fā)多芽體的萌發(fā)，而隨著生長時間的推進，對外源激素濃度的需求降低，高濃度的激素反而不利于不定芽的伸長。

外植體選擇、激素種類和配比是植物組培再生體系的關(guān)鍵因素。由于野生香蕉種子大多結(jié)實率低，通過吸芽繁殖效率也不高，選用阿希蕉合生花作為材料，對芽分化誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基激素濃度進行優(yōu)化篩選，從取材到獲得大批量的根系完整的組培苗，大約需要100 d，繁殖效率可達到100株/花苞以上，增殖效率高，可達到快速增殖繁育的目的。

參考文獻

[1] H?kkinen M， Sharrock S. Diversity in the genus Musa-focus on Rhodochlamys[J]. INIBAP Annual Report， 2001， 8： 16-23.

[2] H?kkinen M. Ornamental bananas： focus on Rhodochlamys[J]. Folia Malaysiana， 2005， 6： 49-72.

[3] H?kkinen M. Musa chunii H?kkinen， a new species （Musaceae） from Yunnan， China and taxonomic identity of Musa rubra[J]. Journal of Systematics and Evolution， 2009， 47（1）： 87-91.

[4] Sabu M， Joe A， Sreejith P E. Musa velutina subsp. markkuana （Musaceae）： a new subspecies from northeastern India[J]. Phytotaxa， 2013， 92（2）： 49-54.

[5] Simmonds N W， Shepherd K. The taxonomy and origins of the cultivated bananas[J]. Journal of the Linnean Society of London Botany， 1955， 55： 302-312.

[6] Joe A， Sabu M， Sreejith P E. A new variety of Musa velutina?H. Wendl. & Drude （Musaceae） from Assam， North-East India[J]. Plant Systematics and Evolution， 2014， 300（1）： 13-17.

[7] 馮慧敏， 陳 ?友， 鄧長娟， 等. 芭蕉屬野生種的地理分布[J]. 果樹學(xué)報， 2009， 26（3）： 361-368.

[8] 李錫文. 云南芭蕉科植物[J]. 植物分類學(xué)報， 1978， 16（3）： 54-64.

[9] H?kkinen M， V?re H. Taxonomic history and identity of Musa dasycarpa， M. velutina and M. assamica （Musaceae） in Southeast Asia[J]. Journal of Systematics and Evolution， 2008， 46（2）： 230-235.

[10] 張光勇， 陳偉強， 劉學(xué)敏， 等. 云南省野生香蕉資源收集及保存[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2011， 34（1）： 36-38.

[11] Uma S， Saraswathi M S， Durai P， et al. Diversity and distribution of section Rhodochlamys （Genus Musa， Musaceae） in India and breeding potential for banana improvement programmes[J]. Plant Genetic Resources Newsletter， 2006， 146： 17-23.

[12] Capdeville G D， Júnior M T S， Szinay D， et al. The potential of high-resolution BAC-FISH in banana breeding[J]. Euphytica， 2009， 166（3）： 431-443.

[13] Kirchoff B K. Inflorescence and flower development in Musa velutina H. Wendl. & Drude （Musaceae）， with a consideration of developmental variability， restricted phyllotactic direction， and hand initiation[J]. International Journal of the Plant Sciences， 2017， 178： 259-272.

[14] 劉偉良， 陳 ?友， 王靜毅， 等. 云南熱帶地區(qū)野生香蕉資源考察及分布現(xiàn)狀分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 27（3）： 31-34.

[15] Wallace R， H?kkinen M. Musa × georgiana， a new intersectional hybrid banana with edible banana breeding relevance and ornamental potential[J]. Nordic Journal of Botany， 2010， 27（3）： 182-185.

[16] H?kkinen M. Ornamental bananas： focus on Rhodochlamys[J]. Chronica Horticulturae， 2007， 47： 7-12.

[17] 張建斌， 賈彩紅， 劉菊華， 等. 香蕉未成熟雄花組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2012， 33（7）： 1225-1229.

[18] Pancholi N， Wetten A， Caligari P D S. Germination of Musa velutina seeds： Comparison of in vivo and in vitro systems[J]. Vitro Cellular & Development Biology Plant， 1995， 31（3）： 127-130.