apelin-APJ系統(tǒng)基因單核苷酸多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系△

史煜 許譯丹 丁波 劉媛 陳力迅 陳春生

迄今為止，全球罹患糖尿病的人數(shù)已超過2.85億，隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇，預(yù)計至2030年，全球糖尿病患者人數(shù)將達(dá)4.39億，糖尿病發(fā)病率的逐年升高，致使糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率也不斷增加[1-2]。糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同影響所致的復(fù)雜性多基因遺傳病。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，遺傳因素在糖尿病的發(fā)病中所起的作用占30%～50%，不僅糖尿病發(fā)病率體現(xiàn)遺傳性，而且糖尿病病情嚴(yán)重程度、是否有并發(fā)癥等方面也體現(xiàn)遺傳性[3]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是臨床上常見且多發(fā)的一種糖尿病微血管并發(fā)癥，臨床癥狀主要表現(xiàn)為黃斑水腫、視網(wǎng)膜微血管瘤、硬性滲出、出血斑點、新生血管及玻璃體積血等，可嚴(yán)重影響患者視功能，是世界上僅次于白內(nèi)障的第二大致盲性眼病，其確切的發(fā)病機(jī)制仍未明確。有研究表明，apelin及其受體APJ基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)在2型糖尿病及其微血管并發(fā)癥的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[4]。Li等[5]驗證了apelin-APJ系統(tǒng)的SNP現(xiàn)象，但目前國內(nèi)外關(guān)于apelin-APJ系統(tǒng)SNP與DR關(guān)系的研究較少，我們就此做一研究，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料橫斷面研究。以我院2017年7月至2018年7月按WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]確診的2型糖尿病患者885例作為研究對象，其中男332例，女553例。依據(jù)2002年DR國際臨床分型標(biāo)準(zhǔn)將患者分為非DR(non-DR，NDR)組與DR組。NDR組539例，其中男168例、女371例；DR組346例，其中男164例、女182例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者個體間無親緣關(guān)系；確診糖尿病時年齡≥50歲，糖尿病病程≥10 a；無DR以外的其他眼部病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：非2型糖尿病者；有其他嚴(yán)重全身疾病或急性并發(fā)癥者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般檢查和眼部檢查血壓計測量右側(cè)肱動脈收縮壓與舒張壓，每間隔5 min測量一次，連續(xù)測量3次取平均值。測量身高、體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)。采取Snellen視力表檢查視力，進(jìn)行裂隙燈顯微鏡及眼底彩色照相檢查。

1.2.2 實驗室檢查晨起空腹抽取前臂靜脈血5 mL，經(jīng)3000 r·min-1離心10 min后取血清，采用SC-150全自動生化分析儀(北京倍肯恒業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)及空腹血糖(fasting blood sugar，F(xiàn)BG)水平。

1.2.3 apelin-APJ系統(tǒng)基因多態(tài)性檢測采用東莞三月三轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)有限公司提供的小量全血基因組DNA快速提取試劑盒抽提DNA，在ABI 7300 Real Time PCR儀器上應(yīng)用Taqman@MGB探針定量PCR方法，檢測rs3115757、rs56204867、rs3761581和APJ基因rs7119375、rs9943582共5個位點的基因分型，以自帶軟件包讀取熒光信號同時對基因進(jìn)行自動分型。

2 結(jié)果

2.1 DR組與NDR組人口基線特征比較無論男性還是女性，除DR組糖尿病病程均較NDR組顯著延長(均為P=0.000)外，DR組與NDR組患者在年齡、收縮壓、舒張壓、BMI、FBG、HbA1c、TG及TC水平上，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見表1。

表1 DR組與NDR組人口基線特征比較

指標(biāo)男DR組(n=164)NDR組(n=168)t值P值女DR組(n=182)NDR組(n=371)t值P值年齡/歲64.51±8.4762.74±8.911.8540.06564.81±8.5363.90±8.861.1490.251糖尿病病程/年15.87±5.1013.18±4.585.0590.00015.91±5.1713.94±4.604.5400.000收縮壓/mmHg139.51±8.60137.85±8.101.8110.071138.64±8.73137.49±8.241.5120.131舒張壓/mmHg89.38±8.2488.60±7.980.8760.38288.42±8.1087.55±7.711.2260.221BMI/kg·m-224.85±3.0124.98±3.200.3810.70324.70±2.8924.64±3.910.1840.854FBG/mmol·L-110.31±5.109.28±4.841.8880.06010.08±5.049.35±4.711.6730.095HbA1c/%9.15±2.648.76±2.501.3820.1689.24±2.708.81±2.521.8410.066TG/mmol·L-11.86±0.811.80±0.780.6880.4921.89±0.831.83±0.800.8190.413TC/mmol·L-15.28±1.145.16±1.150.9550.3405.33±1.185.27±1.170.5650.572

注：1 kPa=7.5 mmHg

2.2 apelin-APJ系統(tǒng)基因型和等位基因在DR組和NDR組的分布apelin基因位于X染色體上，apelin基因的HWE遺傳平衡檢驗僅在女性中進(jìn)行，而APJ基因可在男、女中進(jìn)行。apelin：rs3115757、apelin：rs56204867、apelin：rs3761581、APJ：rs7119375、APJ：rs9943582均存在等位基因，且在DR組和NDR組各基因的多態(tài)性分布均符合HWE平衡(DR組：χ2=0.51，P=0.48；NDR組：χ2=1.38，P=0.24)，顯示受檢人群具有較高的群體代表性。男性apelin基因的3個SNP突變位點rs3115757、rs56204867及rs3761581等位基因頻率在DR組與NDR組間分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；APJ基因2個SNP突變位點rs7119375、rs9943582等位基因頻率在DR組與NDR組間分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。女性的5個SNP突變位點等位基因頻率在DR組與NDR組間分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見表2。

表2 apelin-APJ系統(tǒng)基因型和等位基因在DR組和NDR組的分布

基因型男DR組(n=164)NDR組(n=168)t值P值女DR組(n=182)NDR組(n=371)t值P值apelin:rs3115757 CC--27(14.84)22(16.86)13.7340.001 CG--69(37.91)178(47.98) GG--86(47.25)171(46.09) C89(54.27)25(14.88)57.1010.00062(34.07)108(29.11)1.4080.235 G75(45.73)143(85.12)120(65.93)263(70.89)apelin:rs56204867 CC--38(20.88)48(12.94)6.6060.037 CT--78(42.86)189(50.94) TT--66(36.26)134(36.12) C48(29.27)81(48.21)12.5380.00078(42.86)145(39.08)0.7230.395 T116(70.73)87(51.79)104(57.14)226(60.92)apelin:rs3761581 AA--69(37.91)100(26.95)32.2910.000 AC--71(39.01)234(63.07) CC--42(23.08)37(9.97) A118(71.95)89(52.98)12.7290.000104(57.14)222(59.84)0.3670.545 C46(28.05)79(47.02)78(42.86)149(40.16)APJ:rs7119375 AA3(1.83)29(17.26)23.8160.00020(10.99)45(12.13)6.2760.043 AG64(39.02)47(27.98)78(42.86)119(32.08) GG97(59.15)92(54.76)84(46.15)207(55.80) A36(21.95)50(29.76)60(32.97)122(32.88) G128(78.05)118(70.24)2.6380.104122(67.03)249(67.12)0.0000.984APJ:rs9943582 TT21(12.80)30(17.86)2.0230.36420(10.99)33(8.89)0.6870.709 TC61(37.20)64(38.10)84(46.15)171(46.09) CC82(50.00)74(44.05)78(42.86)167(45.01) T54(32.93)62(36.90)58(31.87)126(33.96) C110(67.07)106(63.10)0.5780.447124(68.13)245(66.04)0.2410.623

注：因apelin基因位于X染色體上，故男性群體無相應(yīng)基因型；括號內(nèi)為百分?jǐn)?shù)(%)

2.3 apelin及其受體APJ基因5個SNP與DR的關(guān)系Logistic回歸分析顯示，調(diào)整了年齡、BMI、FBG后，無論男性還是女性，apelin基因的3個SNP，攜帶rs3115757-C、rs56204867-C、rs3761581-A突變等位基因者患DR的風(fēng)險均明顯高于攜帶相應(yīng)野生等位基因者(均為P<0.05)。無論男性還是女性，APJ基因攜帶rs7119375-A、rs9943582-T突變等位基因者患DR的風(fēng)險與攜帶相應(yīng)野生等位基因者，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見表3。

表3 apelin及其受體APJ基因5個SNP與DR的關(guān)系

性別SNP基因型β值標(biāo)準(zhǔn)誤差χ2值OR值95%CIP值男apelin:rs3115757CC+CG(GG為參照)0.9120.24315.6106.423.81～10.830.000apelin:rs56204867CC+CT(TT為參照)0.8740.22716.2702.561.52～3.910.000apelin:rs3761581AA+AC(CC為參照)0.4650.1747.6482.061.32～3.240.006APJ:rs7119375AA+AG(GG為參照)0.2250.2281.0151.530.75～2.910.274APJ:rs9943582TT+TC(CC為參照)0.1640.1680.9841.470.81～2.740.359女a(chǎn)pelin:rs3115757CC+CG(GG為參照)0.1290.3544.0572.151.15～4.290.039apelin:rs56204867CC+CT(TT為參照)0.5670.2687.7642.181.35～3.540.005apelin:rs3761581AA+ACV(CC為參照)0.8260.34210.8642.151.46～3.150.000APJ:rs7119375AA+AG(GG為參照)0.1230.3540.2491.170.75～1.950.684APJ:rs9943582TT+TC(CC為參照)0.1260.3450.2591.010.65～1.670.684

3 討論

DR是糖尿病患者中常見且多發(fā)的一種眼部并發(fā)癥，常引起視網(wǎng)膜出血、水腫或玻璃體積血等，隨著病情進(jìn)展，可引發(fā)牽拉性視網(wǎng)膜脫離，是導(dǎo)致患者失明的重要原因，尤其是增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜新生血管的形成、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)增多[7]。1993年，O’Dowd等[8]采用同源性克隆方法發(fā)現(xiàn)了一個結(jié)構(gòu)與血管緊張素Ⅱ受體1(angiotensin type 1 receptor，AT1R)相似的蛋白APJ。1998年，Tatemoto等[9]采取反向藥理學(xué)方法首次從牛胃分泌物中提取并純化其內(nèi)源性配體apelin。人類apelin基因位于X染色體q25-26.3，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，可被分解為多個不同亞型，如apelin-12、apelin-16、apelin-17等[10]。APJ基因位于11號染色體q12，含377個氨基酸殘基，是7次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體家族成員之一。APJ無亞型，是現(xiàn)階段唯一已知的apelin受體[11]。Liao等[12]研究顯示，apelin基因的rs3115757位點與中國女性腰圍、BMI密切相關(guān)，CC基因型在高腰圍與高BMI者的比例分別較GG或GC基因型增加了1.07倍、1.29倍。研究證實，apelin可以促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增生、移行及毛細(xì)血管形成[13]。Qin等[14]體外實驗發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)下，apelin-13在視網(wǎng)膜局部的表達(dá)增多，通過PI3K/Akt和MEK/ERK通路增強(qiáng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、Müller細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增生遷移。而在活體狀態(tài)下，尤其是情況更為復(fù)雜的人體內(nèi)，apelin對DR的影響鮮有報道。

本研究通過分析apelin及其受體APJ基因的5個SNP位點與DR的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)apelin基因的3個SNP位點rs3115757、rs56204867及rs3761581可能是DR眾多SNP候選位點之一，且無性別差異。在調(diào)整了年齡、BMI、FBG后，對于apelin基因而言，無論男性還是女性，攜帶rs3115757-C、rs56204867-C、rs3761581-A突變等位基因者患DR的風(fēng)險均分別明顯高于攜帶相應(yīng)野生等位基因者。提示，apelin基因多態(tài)性可能與DR的遺傳機(jī)制有關(guān)，與既往文獻(xiàn)[15]報道基本吻合。本研究結(jié)果還顯示，無論男性還是女性，APJ基因的rs7119375和rs9943582這2個位點從基因型和等位基因分布上，均未觀察到有統(tǒng)計學(xué)意義的差異性。上述結(jié)果提示，配體apelin基因的多態(tài)位點對DR有影響，而受體APJ基因?qū)R無影響。分析原因可能為apelin-APJ系統(tǒng)對DR的影響需要apelin與APJ共同作用才可實現(xiàn)。臨床研究證實，apelin在PDR患者血漿、玻璃體內(nèi)的表達(dá)明顯高于非糖尿病患者[16]。PDR患者纖維血管膜中，apelin-13和APJ均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，纖維膜中多種細(xì)胞成分表達(dá)apelin-13和APJ，且二者與CD31在膜中共表達(dá)，同時二者mRNA水平在纖維血管膜中增高，提示apelin與APJ可能共同參與調(diào)控PDR纖維血管膜的形成及進(jìn)展[17]。Saint-Geniez等[18]進(jìn)行小鼠視網(wǎng)膜血管鋪平原位雜交實驗的結(jié)果表明，msr/APJ轉(zhuǎn)錄與血管生成相關(guān)，且轉(zhuǎn)錄痕跡與表面血管的延伸相符，故其推測apelin-APJ系統(tǒng)可能作為一種促血管生成因子參與視網(wǎng)膜血管的生成，促進(jìn)了DR的發(fā)生進(jìn)展。Du等[19]將糖尿病患者分為NDR組、DR組、PDR組，檢測結(jié)果顯示，血清apelin-13在PDR組患者中的水平均顯著高于其余2組?？梢?，apelin促進(jìn)病理性血管新生，加速已經(jīng)發(fā)生的DR向PDR進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，DR組患者糖尿病病程明顯長于NDR組。Klein等[20]研究表明，DR的發(fā)生與2型糖尿病的病程呈正相關(guān)，病程低于5 a者DR發(fā)生率為38%～39%；病程為5～10 a者DR發(fā)生率提升至50%；一旦病程超過30 a，則DR發(fā)生率可高達(dá)90%，與本文結(jié)果基本吻合。

綜上所述，apelin基因的3個SNP rs3115757、rs56204867、rs3761581與DR的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，但仍需開展大樣本流行病學(xué)調(diào)查，以進(jìn)一步驗證本研究結(jié)果及明確DR的發(fā)病機(jī)制。apelin的促血管生成作用使其在DR等病理性視網(wǎng)膜血管生成的治療中具有巨大的潛力，APJ成為治療DR很有前景的靶點，未來可以考慮利用APJ的阻斷劑治療DR。