阿托伐他汀對慢性腎病大鼠血清及腎組織microRNA-92a 表達(dá)的影響＊

趙婷婷，郭娟英，尚粉青，王 慧，程曼麗，郭 瑄

在慢性腎病發(fā)展過程中硫酸吲哚酚、 吲哚乙酸、 馬尿酸等尿毒癥毒素均可以誘發(fā)microRNA-92a（miR-92a）升高，miR-92a 影響內(nèi)皮細(xì)胞重要調(diào)節(jié)因子Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子2 （Krüppel-like factor 2，KLF2）、Krüppel 樣 轉(zhuǎn) 錄 因 子 4 （Krüppel-like factor 4，KLF4）、 沉 默 信 息 調(diào) 節(jié) 因 子-1（silent information regulator of transcription-1，SIRT1）等的表達(dá)，從而誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能［1］。 有報(bào)道阿托伐他汀可以降低miR-92a 的表達(dá)［2］，該研究目的在于觀察阿托伐他汀是否可以降低慢性腎病的炎癥反應(yīng)及其是否通過降低miR-92a 發(fā)揮治療作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器阿托伐他汀購自輝瑞制藥有限公司。 主要試劑：PCR 引物 （miR-92a、KLF2等）：生工（上海）有限公司合成。 β-actin 抗體購自Santa Cruz 公司；KLF2 抗體購自美國Cell Signaling公司。Trizol 試劑（Invitrogen 公司），HiScriptTMqPCR SuperMix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （Vazyme 公司），PCR DNA聚合酶（Vazyme 公司），其余試劑為國產(chǎn)分析純。 主要儀器： 實(shí)時(shí)定量PCR 儀及梯度PCR 儀 （美國Applied Biosystems 公司），WB 電泳儀和電泳槽、WB 半干轉(zhuǎn)膜槽（BIO-RAD 公司），自動(dòng)洗片機(jī)（柯達(dá)公司）。

1.2 5/6 腎切除慢性腎衰模型的建立選用24 只8～10 周SPF 級雄性SD 大鼠作為研究對象， 購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 所有大鼠均在室溫24 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗，充足水供和飼料。二步法建立5/6 腎切除模型， 以10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，局部剪毛，右側(cè)腹直肌外緣常規(guī)消毒，無菌操作下垂直切口開腹，長約3 cm，暴露右腎，分離固定，按上極、下極弧形切右腎組織，主要切皮質(zhì)，用噴有凝血酶的凝膠海綿壓迫止血，待血止后縫合包扎，切除的右腎組織約占一側(cè)腎臟皮質(zhì)的2/3。 術(shù)后2 周再次手術(shù)，同樣方案麻醉，切開左側(cè)腹部皮膚，暴露左腎，結(jié)扎腎蒂，切除左腎。 假手術(shù)組制備方法：同樣方法麻醉及開腹，不切除腎臟，分離腎周膜，保留腎上腺即關(guān)腹。

1.3 動(dòng)物分組及處理24 只10 周左右SD 大鼠，適應(yīng)環(huán)境1 周，隨機(jī)分成三組：對照組（假手術(shù)組，8只），腎病組（5/6 腎切除組，8 只）；阿托伐他汀干預(yù)組（5/6 腎切除+阿托伐他汀，8 只）。阿托伐他汀給予6 mg/kg·d 水懸液灌胃， 對照組和模型組每天給予等量的生理鹽水灌胃。 大鼠自由進(jìn)食、飲水。 術(shù)后8周處死動(dòng)物，留取標(biāo)本。

1.4 標(biāo)本的采集處死大鼠前1 d， 將大鼠置金屬代謝籠，留取24 h 尿液。 測定24 h 尿蛋白定量。 處死大鼠當(dāng)天用10%水合氯醛麻醉大鼠，取腹腔正中切口，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，提取血清，測定血生化。 取腎臟組織（對照組取右腎中極腎組織，腎病組取剩余的腎組織） 分成1 cm3大小置一80 ℃冰箱保存，用于分子生物學(xué)研究。

1.5 血清各項(xiàng)指標(biāo)的測定用血自動(dòng)生化儀測定血尿素氮、肌酐、膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白。 采用RT-PCR 方法測定血清中miR-92a 的含量，具體方法見文獻(xiàn)［3］。使用ELISA 試劑盒測定血清中hs-CRP 及IL-1β 水平變化。

1.6 腎臟組織各項(xiàng)指標(biāo)的測定（1） 取腎臟組織50 mg，剪碎，加入Trizol 1 ml超聲勻漿，提取腎臟組織RNA，RT-PCR 方法測定腎臟組織中各因子的表達(dá)變化。 PCR 引物序列見表1。 （2）取腎臟組織80 mg/只，剪碎組織，加入蛋白裂解液約300 ml，勻漿機(jī)勻漿，3 次，30 s/次； 液氮凍融3 次，4 ℃，12000 r/min， 離心15 min， 取上清，ABC 法測定蛋白濃度。Western Blot 方法測定腎臟組織中蛋白表達(dá)的變化。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物列表

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，比較采用λ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman。 正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)， 方差齊性檢驗(yàn)采用Levene 檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清中miR-92a 含量變化如圖1 所示，與正常對照組相比，腎病組大鼠血清miR-92a 水平顯著升高 （腎病組值5.181 vs. 對照組值1.134，P＜0.01）。 阿托伐他汀治療組血清miR-92a 水平較腎病組明顯降低 （他汀治療組值2.250 vs. 腎病組值5.181，P＜0.05）。

圖1 三組大鼠血清中miR-92a 含量變化

2.2 血清中一般生化指標(biāo)及CRP 及IL-1β 等炎癥指標(biāo)變化與正常對照組相比，腎病組尿素氮和肌酐明顯升高，血漿總膽固醇（TC）（P＜0.01）及低密度脂蛋白（LDL-C）亦顯著升高（P＜0.05）。 阿托伐他汀治療組與腎病組比較，TC 和LDL-C 降低 （P＜0.01），尿素氮和肌酐明顯降低，兩組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P 值分別＜0.05 和＜0.01）。 但三酰甘油（TG）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平在治療前后無明顯變化（P＞0.05）。炎癥指標(biāo)CRP 及IL-1β 在腎病組明顯升高（P＜0.01），阿托伐他汀治療后明顯降低（P＜0.05）。 見表2。

表2 三組血清生化指標(biāo)的比較

Spearman 相關(guān)分析顯示，血清中miR-92a 的水平與血清中炎癥指標(biāo)CRP 及IL-1β 具有明確的相關(guān)性，呈顯著正相關(guān)。 見圖2。

圖2 血清中miR-92a 與CRP 及IL-1β 相關(guān)性分析

2.3 腎臟組織中miR-92a 及其下游靶基因KLF2表達(dá)變化RT-PCR 結(jié)果提示腎病組腎臟組織中miR-92a 表達(dá)較對照組明顯增加（P＜0.01），而阿托伐他汀治療組較腎病組表達(dá)明顯減少 （P＜0.05）。RT-PCR 及Western Blot 結(jié)果提示腎病組腎臟組織中KLF2 表達(dá)較對照組明顯減少（P＜0.01），而阿托伐他汀治療組較腎病組表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。 見圖3。

圖3 腎臟組織中miR-92a 與KLF2 表達(dá)變化

3 討 論

慢性腎?。–KD）嚴(yán)重危害著全世界人民的健康與生命。 國內(nèi)外有關(guān)資料表明，慢性腎病的發(fā)病率、患病率以及患者知曉率迅速上升［4］。這已成為當(dāng)今腎病專業(yè)以及醫(yī)學(xué)界面臨的嚴(yán)峻公共衛(wèi)生與醫(yī)療問題。 因此尋找有效的治療方法刻不容緩。

microRNA 在慢性腎病中的研究日益深入，已發(fā)現(xiàn)有多種microRNA 參與腎病的發(fā)生及發(fā)展［5-9］。miR-29、miR-302、miR-192 和miR-21 在慢性腎病發(fā)病過程中均發(fā)揮重要作用。 miR-92a 是內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)的microRNA， 屬于miR17-92 基因簇，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的癌基因，其表達(dá)上調(diào)被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。 我們前期研究證實(shí)慢性腎病患者血清miR-92a 顯著升高，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)心腦血管并發(fā)癥發(fā)生。而對于miR-92a在腎功能損傷的進(jìn)展過程中的作用尚不清楚。 該研究證實(shí)在5/6 腎切除模型大鼠的血清及腎臟組織中miR-92a 的表達(dá)均明顯增加。

慢性腎病進(jìn)展過程中，在各種致病因素的作用下，炎癥細(xì)胞和腎固有細(xì)胞（如系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞）合成和分泌多種炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，在腎病發(fā)生、發(fā)展中起了關(guān)鍵作用。 因此抑制炎癥反應(yīng)對延緩腎病的進(jìn)展有重要的意義。 miR-92a通過作用于其靶基因KLF2［10］來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。KLF2 受血流切應(yīng)力誘導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)炎癥、凝血、血管舒縮和血管生成等多種過程。KLF-2 通過抑制炎癥關(guān)鍵通路核因子-kappa B （nuclear factor-κB，NF-κB） 和轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1 （activator protein 1，AP-1）的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，進(jìn)而抑制單核細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)［11］。KLF2 還能抑制蛋白激酶活化受體-1，抑制凝血酶誘導(dǎo)的MCP-1、IL-6 和IL-8 的表達(dá)［12］。此外KLF2 還能抑制IL-1β 和TNF-α 等促炎因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子如E-選擇素、血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1 的表達(dá)，從而抑制炎癥細(xì)胞黏附［13］。

阿托伐他汀首先是通過糾正脂代謝紊亂來減輕高脂血癥對腎臟的損害。 阿托伐他汀的腎保護(hù)作用機(jī)制亦可通過非依賴降脂作用機(jī)制參與：抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減少細(xì)胞外基質(zhì)、抗炎作用及調(diào)節(jié)免疫功能等。 阿托伐他汀可以通過抑制炎癥因子的表達(dá)、炎癥細(xì)胞的活化等起抗炎作用來延緩CKD 的進(jìn)展。有研究證實(shí)他汀類藥物治療可顯著降低冠心病患者血清miR-92a 水平［2］。 該研究提示，阿托伐他汀可能通過抑制miR-92a 的表達(dá)， 促進(jìn)KLF2 表達(dá)增加，從而有效抑制炎癥反應(yīng)，延緩慢性腎病的進(jìn)展。

通過該研究筆者證實(shí)了miR-92a 在CKD 進(jìn)展過程中的重要作用及阿托伐他汀通過抑制miR-92a 的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，延緩腎病發(fā)展。而miR-92a 在腎病進(jìn)展中是否有其他作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明miR-92a 抑制劑可延緩動(dòng)脈硬化的發(fā)展。 而miR-92a 抑制劑是否可作為CKD的治療方法仍有待進(jìn)一步評估及驗(yàn)證。