單核巨噬細(xì)胞亞群在結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺病中的表達(dá)研究

王麗平，陳雪芬，趙茂，李學(xué)任，劉斌△，彭守春△

單核細(xì)胞因具有吞噬和產(chǎn)生細(xì)胞因子、促進(jìn)膠原合成以及血管生成等作用，從而在炎癥及免疫反應(yīng)中扮演重要角色。2010年國(guó)際單核細(xì)胞/樹(shù)突細(xì)胞命名委員會(huì)根據(jù)細(xì)胞表面CD14和CD16的表達(dá)情況，將人類(lèi)循環(huán)中的單核細(xì)胞分為經(jīng)典型（CD14++CD16-，Mon1）、中間型（CD14++CD16+，Mon2）和非經(jīng)典型（CD14+CD16++，Mon3）3 個(gè)亞群［1］。在疾病狀態(tài)下，單核細(xì)胞亞群的分化及功能狀態(tài)發(fā)生改變從而參與疾病的發(fā)展過(guò)程，例如循環(huán)中的CD16+單核細(xì)胞增加［2-3］，并與不良臨床預(yù)后有關(guān)［4-5］。

與單核細(xì)胞相似，巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的異質(zhì)性，隨周?chē)h(huán)境的變化發(fā)生亞群的偏移和功能狀態(tài)的改變［6］。目前巨噬細(xì)胞可分為M1型和M2型，其中M2型巨噬細(xì)胞在纖維化期促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積、瘢痕形成中發(fā)揮重要作用，與多種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，在炎癥條件下，Ly-6Clow單核細(xì)胞可能是肺巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞［7］。本課題組前期研究證實(shí)，在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，單核巨噬細(xì)胞亞群均呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化［8］，與間質(zhì)性肺病（interstitial lung disease，ILD）的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。而目前單核巨噬細(xì)胞亞群在結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變（connective tissue associated interstitial lung disease，CTD-ILD）中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究通過(guò)對(duì)CTD-ILD患者、單純CTD（CTD-nILD）患者、健康體檢者循環(huán)單核細(xì)胞亞群及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中巨噬細(xì)胞亞群的測(cè)定，進(jìn)一步探討不同單核巨噬細(xì)胞亞群在CTD-ILD 中的表達(dá)水平，為下一步探討單核巨噬細(xì)胞不同亞群在CTD-ILD發(fā)病中的作用打下基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集于2017年7月—2018年2月在中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科住院的CTD 患者 77 例，其中男 21 例，女 56 例，年齡 30～83 歲，平均（60.17±12.78）歲。將患者分為單純CTD組（CTD-nILD組）30例和CTD 合并ILD 組（CTD-ILD 組）47 例。同時(shí)選取年齡及性別相仿的健康體檢者30例作為健康對(duì)照組（NC組）。3組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。將CTD-ILD 組中行支氣管鏡檢查的患者作為試驗(yàn)組，選取不明原因咳嗽或胸悶、且支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)常規(guī)檢查無(wú)異常的患者作為對(duì)照組。該組患者行支氣管鏡檢查的目的在于排除支氣管疾病以明確診斷。收集2 組患者的BALF 檢測(cè)巨噬細(xì)胞亞群，其中試驗(yàn)組25例，男10例，女15例，平均年齡（59.44±10.74）歲。對(duì)照組20 例，男8 例，女12 例，平均年齡（44.90±9.04）歲。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審查同意，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

Tab.1 Comparison of the general data between three groups表1 各組研究對(duì)象一般資料比較

1.2 診斷、納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 診斷標(biāo)準(zhǔn)：所選病例應(yīng)符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）提出的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）診斷標(biāo)準(zhǔn)、2012年系統(tǒng)性紅斑狼瘡國(guó)際臨床協(xié)作組（SLICC）修訂的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)、1975年Bohan 提出的多發(fā)性肌炎/皮肌炎（PM/DM）診斷標(biāo)準(zhǔn)、2002年干燥綜合征（SS）國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)、2013年ACR/EULAR 系統(tǒng)性硬化癥（SSc）分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)、1999年Danieli 提出的未分化結(jié)締組織病（UCTD）的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及1987年Sharp提出的混合型結(jié)締組織?。∕CTD）的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，CTD-ILD 組中 RA 患者 17 例，SLE 患者 1 例，PM/DM 患者 9 例，SS 患者 8 例，SSc 患者 5 例，UCTD 患者 3 例，MCTD 患者 4 例；CTD-nILD 組中 RA 患者 14 例，SLE 患者 4例，PM/DM患者1例，SS患者4例，SSc患者2例，UCTD患者3例，MCTD患者2例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～70 歲，入選患者均無(wú)糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑使用史，或已停用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑半年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）除外環(huán)境因素、職業(yè)因素、藥物因素及感染因素等其他原因?qū)е碌腎LD。（2）合并有惡性腫瘤、感染、肺靜脈閉塞，慢性阻塞性肺疾病等。（3）妊娠及哺乳期婦女。（4）職業(yè)、藥物、遺傳、環(huán)境因素引起的肺部病變，家族性特發(fā)性肺纖維化。（5）嚴(yán)重臟器功能不全如肺動(dòng)脈高壓，先天性心臟病，左心功能衰竭等。（6）近期發(fā)生肺部感染者。

1.3 方法

1.3.1 一般臨床資料的收集 收集入組患者的性別、年齡、胸部高分辨率CT（High resolution CT，HRCT）檢查、肺功能檢查［包括用力肺活量（FVC）、一氧化碳彌散量（TLCO）］等臨床資料。

1.3.2 主要試劑與儀器 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞亞群所用抗CD14-FITC、抗CD16-PE、抗CD86-PE-Cy5及抗CD41-PE-Cy7 抗體均購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞亞群所用抗CD11b-FITC、抗CD169-PE、抗CD206-PE-Cy5、抗CD163-PE-Cy7 抗體均購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司。流式細(xì)胞儀Cytomics FC 500 購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter 公司，肺功能儀購(gòu)自德國(guó)Master Screen Diffusion公司，電子支氣管鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

1.3.3 外周血單核細(xì)胞亞群檢測(cè)方法 所有患者入院后24 h 內(nèi)采取晨起空腹外周靜脈血2 mL，血液樣本在采血后2 h內(nèi)須完成單核細(xì)胞亞群流式細(xì)胞術(shù)分析。取新鮮EDTA抗凝全血標(biāo)本 50 μL 加入 10 μL 抗人CD14、10 μL 抗人CD16、10 μL抗人CD86、10 μL抗人CD41進(jìn)行抗體標(biāo)記。室溫避光條件下孵育15 min 后加1 mL 紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻后孵育10 min，上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)CD14和CD16的熒光強(qiáng)度不同劃分為Mon1、Mon2 和Mon3 亞群。流式結(jié)果的分析采用FlowJo 7.6軟件。

1.3.4 BALF 巨噬細(xì)胞亞群檢測(cè)方法 新鮮BALF 100 μL加入20 μL CD11b、CD169、CD206 熒光抗體混勻孵育20 min，300×g離心5 min 棄上清；加1∶9配制的溶血素2 mL，避光10 min，200×g離心5 min棄上清液；加入PBS緩沖液，300×g離心5 min 棄上清，加0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)待測(cè)。根據(jù)CD163+/CD163++的表達(dá)情況分析巨噬細(xì)胞亞型比例。流式結(jié)果分析采用FlowJo 7.6軟件。

1.3.5 ILD 患者的HRCT 表現(xiàn) 由1 位放射科醫(yī)師和2 位呼吸科醫(yī)師分別對(duì)胸部HRCT的病變范圍進(jìn)行評(píng)估，取主動(dòng)脈弓上緣、隆突、膈肌上1 cm 水平，分別計(jì)算3 個(gè)層面纖維化（蜂窩影和網(wǎng)格影）和磨玻璃影占相應(yīng)肺野面積的百分比。當(dāng)受累面積為0 時(shí)為0 分，1%～25%時(shí)計(jì)1 分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3 分，76%～100%計(jì)4 分，將評(píng)分相加即為相應(yīng)評(píng)分。

1.3.6 肺功能檢查 用鼻夾將患者鼻子夾住，盡可能含緊一次性口含嘴，患者平靜呼吸4～5 個(gè)循環(huán)，待潮氣末基線平穩(wěn)后，讓患者快速呼氣至殘氣量位；然后快速均勻吸氣至肺總量位；接著屏氣10 s，最后在2～4 s內(nèi)用力將全部氣體均勻呼出至殘氣量位；再做1次平靜呼吸，記錄FVC和TLCO。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組組間比較采用單因素方差分析，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD-t法進(jìn)行組間多重比較；方差不齊時(shí)用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較。正態(tài)分布的連續(xù)型變量資料之間采用Pearson 檢驗(yàn)行相關(guān)性分析，非正態(tài)分布的連續(xù)型變量資料之間采用Spearman 檢驗(yàn)行相關(guān)性分析。以雙側(cè)α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 循環(huán)單核細(xì)胞亞群比例檢測(cè)結(jié)果 CTD-nILD組和 CTD-ILD 組 Mon1 亞群比例低于 NC 組（P＜0.05），CTD-nILD 組與 CTD-ILD 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CTD-nILD組和CTD-ILD組Mon2亞群比例均明顯高于NC 組，CTD-ILD 組高于CTD-nILD 組（P＜0.05）；Mon3 亞群比例在 NC 組、CTD-nILD 組和CTD-ILD 組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

Tab.2 Monocyte subsets detected by flow cytometry in three groups表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組循環(huán)單核細(xì)胞亞群比例分布情況

2.2 CTD-ILD 組單核細(xì)胞亞群水平與HRCT 評(píng)分的相關(guān)性分析 47 例CTD-ILD 患者均完成HRCT檢查，Pearson 相關(guān)分析顯示，Mon2 亞群比例與HRCT磨玻璃影評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

Tab.3 Correlation of the percentage of monocyte subsets with HRCT scores in the CTD-ILD group表3 CTD-ILD組單核細(xì)胞亞群比例與HRCT評(píng)分的相關(guān)性分析

2.3 CTD-ILD 組循環(huán)單核細(xì)胞亞群水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 CTD-ILD 組共有36 例患者行肺功能檢查，其中29例完成彌散功能檢查。Pearson相關(guān)分析顯示，單核細(xì)胞3 個(gè)亞群比例與肺功能指標(biāo)均無(wú)線性相關(guān)關(guān)系（均P＞0.05）。見(jiàn)表4。

2.4 BALF 巨噬細(xì)胞亞群比例檢測(cè)結(jié)果 試驗(yàn)組M1 比例明顯低于對(duì)照組，M2 比例高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表5。25例試驗(yàn)組患者均完成HRCT檢查，Pearson 相關(guān)分析顯示，巨噬細(xì)胞亞群比例與HRCT評(píng)分均無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系（均P＞0.05），見(jiàn)表6。試驗(yàn)組患者均行肺功能檢查，Pearson 相關(guān)分析顯示，M2巨噬細(xì)胞與肺功能指標(biāo)均無(wú)線性相關(guān)關(guān)系（均P＞0.05），見(jiàn)表7。

Tab.4 Correlation of the percentage of monocyte subsets with pulmonary function test index in the CTD-ILD group表4 CTD-ILD組單核細(xì)胞亞群比例與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

Tab.5 Macrophage subsets detected by flow cytometry in the two groups表5 試驗(yàn)組和對(duì)照組BALF巨噬細(xì)胞亞群比例分布情況

Tab.6 Correlation of the percentage of monocyte subsets with HRCT scores in the CTD-ILD group表6 試驗(yàn)組巨噬細(xì)胞亞群比例與HRCT評(píng)分的相關(guān)性分析

Tab.7 Correlation of the percentage of macrophage subsets with pulmonary function test index in the experimental group表7 試驗(yàn)組巨噬細(xì)胞亞群比例與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.5 Mon2 單核細(xì)胞亞群與M2 巨噬細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析 將CTD-ILD 組巨噬細(xì)胞亞群比例與相對(duì)應(yīng)的外周血單核細(xì)胞亞群比例進(jìn)行相關(guān)分析顯示，單核細(xì)胞亞群分化和巨噬細(xì)胞亞群分化之間無(wú)明顯線性相關(guān)關(guān)系（均P＞0.05），見(jiàn)表8。

Tab.8 Correlation of the percentage of monocyte subsets with the percentage of macrophage subsets in the CTD-ILD group表8 CTD-ILD組單核細(xì)胞亞群比例與巨噬細(xì)胞亞群比例的相關(guān)性分析

3 討論

在正常人體內(nèi)，CD14++CD16-單核細(xì)胞群約占單核細(xì)胞的90%，CD16+單核細(xì)胞群約占10%，其進(jìn)一步分為CD14++CD16+亞群和CD14+CD16++亞群［1］。研究表明，Mon2單核細(xì)胞比例升高可能與一些炎癥性疾病或纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，如RA［9］和肝纖維化［10］。另有研究指出Mon1和Mon2單核細(xì)胞比例的升高與特發(fā)性肺纖維化（IPF）進(jìn)展相關(guān)，尤其是Mon2 單核細(xì)胞比例的升高提示IPF 患者預(yù)后更差［11］?？梢?jiàn)，單核細(xì)胞向Mon2亞群偏移可產(chǎn)生更強(qiáng)的促炎作用，與ILD 的發(fā)生有密切關(guān)系。同時(shí)多項(xiàng)研究表明，巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化可能參與纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展［12］，在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，M2型巨噬細(xì)胞在第14天左右達(dá)峰值，并且與肺纖維化的程度呈現(xiàn)明顯正相關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示，CTD-ILD患者的外周血Mon2單核細(xì)胞亞群比例以及BALF 中M2巨噬細(xì)胞亞群比例均明顯升高，提示二者在CTD-ILD 的不同病理階段可能發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，Mon2單核細(xì)胞可分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β等，從而在疾病狀態(tài)中發(fā)揮更強(qiáng)的促炎作用［14］。同時(shí)Mon2 亞群已經(jīng)被證明可以通過(guò)表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化，增加膠原沉積［7］。因此，Mon2 單核細(xì)胞比例的升高與一些炎癥性疾病/纖維化疾病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與NC 組相比，CTD-nILD 組與 CTD-ILD 組患者 Mon2 單核細(xì)胞比例均升高，其中CTD-ILD 患者M(jìn)on2 比例升高更顯著。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在CTD-ILD患者中，Mon2水平與HRCT的磨玻璃影評(píng)分呈正相關(guān)，提示Mon2可能在ILD早期炎癥反應(yīng)階段發(fā)揮更重要的作用。但是未發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞與肺功能指標(biāo)之間的關(guān)系，可能與樣本量較小或者單核細(xì)胞檢測(cè)與肺功能檢測(cè)不是同時(shí)期完成有關(guān)。

本課題組前期結(jié)果顯示，博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷小鼠從炎癥期到損傷修復(fù)期，BALF 中M1 巨噬細(xì)胞逐漸減少，M2型巨噬細(xì)胞逐漸增多［13］。在IPF患者和SSc-ILD 患者中，M2 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CCL-18 明顯增高，同時(shí)與肺纖維化程度呈正相關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組M2比例明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明在CTD-ILD 患者中巨噬細(xì)胞有向M2 亞群偏移的傾向，與以往研究結(jié)果一致。但是本研究并未發(fā)現(xiàn)M2 巨噬細(xì)胞比例與纖維化評(píng)分之間的相關(guān)關(guān)系，應(yīng)當(dāng)注意到二者呈正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)較大。下一步應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并且優(yōu)化檢測(cè)方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

Lescoat 等［16］研究顯示，CD16+單核細(xì)胞不僅與SSc患者肺纖維化嚴(yán)重程度和DLCO的減少有關(guān)，而且還被認(rèn)為是M2巨噬細(xì)胞的前體。由此猜測(cè)，CTD患者外周血CD16+單核細(xì)胞的增加很有可能導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞增多，從而在ILD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［17］。但是本研究中未發(fā)現(xiàn)CD16+單核細(xì)胞與M2巨噬細(xì)胞之間存在相關(guān)性，下一步應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步觀察單核巨噬細(xì)胞在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相互關(guān)系。

綜上所述，Mon2 單核細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞在CTD-ILD 中均顯著增高，提示Mon2 單核細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞在ILD 的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。尤其是Mon2與HRCT磨玻璃影評(píng)分呈正相關(guān)，提示Mon2單核細(xì)胞可能在評(píng)價(jià)病情方面發(fā)揮一定作用，為進(jìn)一步研究單核巨噬細(xì)胞亞群在CTD-ILD 發(fā)病機(jī)制中的作用提供參考。