炎癥預(yù)激活間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基調(diào)控壞死性小腸結(jié)腸炎小腸炎性反應(yīng)的作用研究

朱小波，馬發(fā)鑫，馮琳，鄭躍，沙衛(wèi)紅，陳浩

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）是新生兒，特別是早產(chǎn)兒最為常見的消化系統(tǒng)急危重癥，其病死率可高達30%，嚴(yán)重地危害了患兒生命［1-2］。NEC的發(fā)病機制尚未明確，一般文獻報道有以下幾種危險因素：（1）腸上皮細胞的缺血缺氧性損傷；（2）腸道發(fā)育不成熟；（3）腸道微生物群的異常定植；（4）配方奶喂養(yǎng)等［2-5］。病理特征主要以回腸末端的損害最為嚴(yán)重，并且病情發(fā)展快，目前臨床無有效的治療措施，存活者中仍有約半數(shù)存留營養(yǎng)不良、腸狹窄、短腸綜合征等后遺癥［6-7］。故當(dāng)前亟需針對其發(fā)病機制尋找更有效的防治方法。

間充質(zhì)干細胞（MSCs）是一類在特定條件下具有多向分化潛能的干細胞，其對組織損傷的修復(fù)作用已在心臟、肝臟、肺及小腸等器官被證實。除此之外，MSCs還具有強大的免疫調(diào)節(jié)和抗炎能力，可調(diào)控放射性小腸炎、炎癥性腸病、骨髓移植等疾病的炎性反應(yīng)［8-11］。近年研究表明，在NEC發(fā)病過程中，Toll樣

受體炎癥信號通路被激活，從而啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)多種促炎因子包括白介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的升高，參與腸道損傷和炎性反應(yīng)；而過量上皮細胞的凋亡和炎性因子的釋放可能造成腸道局部缺血壞死，進而導(dǎo)致消化道炎癥的發(fā)生，加重NEC的病情［12-13］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)不同狀態(tài)間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基（MSC-CM）能下調(diào)多種小腸損傷炎性反應(yīng)，對腸道起到保護作用［14］，但對NEC炎性反應(yīng)的作用和機制尚未明確，故本研究旨在探討炎癥激活前后不同狀態(tài)MSC-CM對NEC炎性反應(yīng)調(diào)控作用的差異及其機制，為探索NEC新的治療手段提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗時間與地點 2018年7月—2019年4月，在廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）中心實驗室、中山大學(xué)中心實驗室、華南理工實驗動物中心完成本實驗。

1.2 實驗動物 清潔級新生Sprague-Dawley（SD）孕鼠，用于獲得早產(chǎn)新生大鼠，早產(chǎn)新生大鼠雌雄不限，用于建立NEC模型。雌性SD大鼠，3～4周齡，體質(zhì)量60～80 g，SPF級，用于獲取骨髓MSCs。均由中山大學(xué)北校區(qū)實驗中心、華南理工實驗動物中心提供，所有動物經(jīng)檢疫符合實驗動物標(biāo)準(zhǔn)，實驗方法符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.3 實驗試劑與材料 Similac配方奶粉（美國Abbott公司）；保育箱和缺氧箱（中山大學(xué)北校區(qū)實驗中心）；DMEM-F12培養(yǎng)基（美國Hycolne公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；胎牛血清（美國Hycolne公司）；TrypLEExpress胰酶代替物（美國Invirogen公司）；抗大鼠CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC單克隆抗體（美國Biolegend公司）；CD4和Foxp3單克隆抗體（美國eBiosciences公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 參照課題組既往文獻的實驗方法［15］，經(jīng)原代分離、培養(yǎng)、傳代后使用流式細胞儀對細胞表型CD29、CD34、CD44、CD45進行鑒定。

1.4.2 MSC-CM的制備 參照課題組既往文獻的實驗方法［15］，在MSCs培養(yǎng)基中同時添加外源性TNF-α（6 ng/ml，美國加利福尼亞州eBiosciences公司）、IL-1β（3 ng/ml，美國加利福尼亞州eBiosciences公司）、一氧化氮（NO）供體（硝普鈉，sodium nitroprusside；200 μmol/L）模擬炎癥刺激環(huán)境，24 h后棄去培養(yǎng)基，更換2 ml新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集該培養(yǎng)液，此為TNF-α、IL-1β和一氧化氮（NO）聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)的炎癥預(yù)激活間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基（MSCCMTNF-α+IL-1β+NO）。采用類似方法，收集未加入外源性TNF-α、IL-1β和NO激活的培養(yǎng)液，此為正常間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基（MSC-CMNOR）。隨后用5 kDa的離心超濾管，3 000 r/min（離心半徑 5 cm）離心 20 min；此時培養(yǎng)基濃縮約50倍，0.22 μmol/L濾器過濾滅菌，于-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 新生大鼠NEC模型建立 根據(jù)文獻方法［16-17］，于母鼠妊娠21 d時采用剖宮術(shù)獲得早產(chǎn)新生大鼠，置于新生鼠保育箱內(nèi)進行人工喂養(yǎng)。缺氧和冷刺激：密閉缺氧箱上充入氮氣，調(diào)整環(huán)境為95%氮氣+5%氧氣，10 min后打開箱蓋取出新生大鼠；隨后將新生大鼠置于4 ℃低溫冰箱，維持10 min后取出新生大鼠，如此缺氧聯(lián)合冷刺激處理2次/d，間隔12 h，連續(xù)3 d。脂多糖（0.5 mg/ml）灌胃，1次/d，0.1 ml/次，處理2次，間隔12 h。經(jīng)上述處理，距回盲部10～15 cm取出小腸約2 cm，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗腸腔，40 g/L多聚甲醛溶液固定，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察小腸組織病理學(xué)改變，使用雙盲法，由2位及以上病理科醫(yī)師根據(jù)CAPLAN等［18］的評分標(biāo)準(zhǔn)獨立對切片進行評分。分級標(biāo)準(zhǔn)：0級為腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1級為輕微黏膜下層和/或固有層分離；2級為中度黏膜下層和/或固有層分離，或者黏膜下層和肌層水腫；3級為嚴(yán)重黏膜下層和/或固有層分離，或者黏膜下層和肌層嚴(yán)重水腫，局部絨毛脫落；4級為腸絨毛消失伴腸壁全層壞死。病理學(xué)評分≥2分確診為NEC。

1.4.4 給藥方式 隨機選取SD孕鼠早產(chǎn)的80只新生大鼠，根據(jù)處理方式分為對照組、單純NEC損傷組、NEC損 傷 +MSC-CMNOR組、NEC損 傷 +MSCCMTNF-α+IL-1β+NO組，每組 20只。采用腹腔注射的方式，所有實驗新生大鼠出生即按照分組分別注射等量的0.9%氯化鈉溶液（對照組）、DMEM-F12培養(yǎng)基（單純NEC損傷組）、MSC-CMNOR（NEC損傷+MSCCMNOR組 )及 MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO（NEC 損 傷 +MSCCMTNF-α+IL-1β+NO組）。每只新生大鼠每天腹腔一次性注射給藥 200 μl，連續(xù)注射 3 d。

1.4.5 小腸大體標(biāo)本留取及病理學(xué)檢查 各組在實驗第4天，空腹12 h后斷頸處死新生大鼠取材，開腹觀察小腸大體標(biāo)本，距回盲部10～15 cm取出小腸約2 cm，PBS沖洗腸腔，40 g/L多聚甲醛溶液固定，HE染色，光鏡下觀察小腸病理學(xué)改變；同時收集距回盲部5 cm的回腸組織約50 mg用于ELISA檢測。各組新生大鼠均經(jīng)心臟取血 1.0～1.5 ml，室溫下靜置 30 min，3 000 r/min（離心半徑5 cm）離心10 min，收集血清，-20 ℃保存用于ELISA檢測。

1.4.6 血清和小腸組織中促炎因子和抑炎因子水平的檢測 從4組新生大鼠中各隨機選取10只，取血清和小腸組織標(biāo)本，將小腸組織在冰0.9%氯化鈉溶液中漂洗，濾紙拭干，取10 mg小腸組織加入1 ml冰0.9%氯化鈉溶液研磨，制備組織勻漿，4 ℃ 12 000 r/min（離心半徑5 cm）離心20 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書步驟分別檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10及IL-12水平，小腸組織勻漿上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平。

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。對小腸組織的病理學(xué)評分進行Kruskal-Wallis H檢驗分析；計量資料以（x±s）表示，各組間TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12及IL-10水平比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新生大鼠一般狀況 對照組新生大鼠各項指標(biāo)正常，活力良好。單純NEC損傷組及NEC損傷+MSC-CMNOR組新生大鼠在造模成功24 h后出現(xiàn)食欲不振、腹脹、腹瀉或排黏液血便；表現(xiàn)為嗜睡、活動量減少及反應(yīng)遲鈍，程度逐漸加重，體質(zhì)量減輕。NEC損傷+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組新生大鼠在造模成功 48 h 后出現(xiàn)輕度腹脹及排黃色黏液便癥狀，活動量減少，程度較單純NEC損傷組新生大鼠明顯減輕。

2.2 腸道組織病理學(xué)改變

2.2.1 各組小腸大體標(biāo)本變化 對照組新生大鼠小腸色澤紅潤，無充血，彈性好，有蠕動，未見腸壁積氣或壞死。單純NEC損傷組新生大鼠及NEC損傷+MSCCMNOR組新生大鼠腸道色澤呈暗紅色，充血明顯，可見腸壁積氣、壞死，彈性差，腸管擴張。NEC損傷+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組新生大鼠腸道輕度充血，未見腸壁積氣或壞死，彈性尚可。

2.2.2 光鏡下各組小腸組織病理學(xué)改變 對照組新生大鼠回腸絨毛完整，腺體結(jié)構(gòu)排列規(guī)整，固有層血管無擴張，無炎性細胞浸潤。單純NEC損傷組新生大鼠及NEC損傷+MSC-CMNOR組新生大鼠可見絨毛有不同程度的脫落壞死，腺體排列紊亂，黏膜層及黏膜下層充血、水腫，肌層變薄或斷裂。NEC損傷+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組新生大鼠回腸絨毛尚完整，黏膜及黏膜下層輕度充血、水腫，未見肌層破壞（見圖1）。

2.2.3 各組小腸組織病理學(xué)評分 對照組、單純NEC損傷組、NEC損傷+MSC-CMNOR組、NEC損傷+MSCCMTNF-α+IL-1β+NO組病理學(xué)評分總分為16、51、43、16分，4組病理學(xué)評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=41.70，P＜0.01）。 其中單純NEC損傷組、NEC損傷+MSCCMNOR組病理學(xué)評分高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-5.07、-4.57，P＜0.01），NEC 損 傷 +MSCCMTNF-α+IL-1β+NO組病理評分較單純NEC損傷組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-4.50，P＜0.01），NEC損傷+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組與對照組病理學(xué)評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-0.25，P＞0.05）。對照組無NEC發(fā)生，單純NEC損傷組、NEC損傷+MSC-CMNOR組、NEC 損 傷 +MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組 分 別 有 17、16、4只診斷為NEC（NEC發(fā)生率為85.0%、80.0%、20.0%）；4組NEC發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=44.00，P＜0.001）。

2.3 各組血清和小腸組織中促炎因子和抑炎因子水平對照組、單純NEC損傷組、NEC損傷+MSC-CMNOR組、NEC 損 傷 +MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組 血 清 中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，與單純NEC損傷組、NEC損傷+MSC-CMNOR組相比，NEC 損傷 +MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12水平降低，IL-10水平升高，MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，IL-10水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表1～2）。

圖1 NEC造模后第4天小腸組織病理學(xué)改變（蘇木素-伊紅染色，×100）Figure 1 Histological changes of intestine tissues on the 4th day after NEC modeling

3 討論

近年來盡管危重新生兒的救治成功率有了很大的提高，但是對于NEC這一個新生兒常見危重癥的發(fā)病機制尚未明確，對于NEC的預(yù)防和治療亦缺乏有效的方案。隨著早產(chǎn)兒出生增加，極低出生體質(zhì)量兒增加，NEC發(fā)病率亦出現(xiàn)逐步增加的趨勢，因此亟需探索NEC的發(fā)病機制及新的診治手段。

本研究利用TNF-α、IL-1β和NO模擬腸道炎癥環(huán)境，造模情況比較理想。首先，本研究結(jié)果顯示NEC損傷造模成功的新生大鼠均有不同程度的腹脹、腹瀉、反應(yīng)遲鈍、活動減少、體質(zhì)量下降等表現(xiàn)，通過病理學(xué)檢查可見腸壁出現(xiàn)不同程度的黏膜層和黏膜下層充血、水腫、絨毛壞死脫落，大量炎性細胞浸潤。其次，本研究結(jié)果顯示，與單純NEC損傷組及NEC損傷+MSCCMNOR組相比，NEC 損傷 +MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12明顯降低，抑炎因子IL-10明顯升高，小腸組織中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8明顯下降，抑炎因子IL-10明顯升高。由此提示炎癥預(yù)激活MSC-CM對NEC有修復(fù)黏膜的作用及抑制腸道炎癥的作用。

炎癥和氧化應(yīng)激是NEC重要的發(fā)病機制。CARLISLE等［19］報道，NEC發(fā)展的早期腸道菌群通過微生物相關(guān)分子模式（MAMPs）識別受體如TLR4，激活轉(zhuǎn)錄因子核因子（NF）-κB，促進炎性因子和自由基的表達。有研究表明，在NEC患兒的腸道組織及血清中檢測到炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表達增高［20-23］。過度炎癥進一步趨化了炎性細胞，如嗜中性粒細胞，誘導(dǎo)活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，并對腸屏障造成進一步損害，導(dǎo)致細菌移位增加，腸上皮損傷，上皮細胞恢復(fù)受損，細胞凋亡和黏膜壞死。因此，嚴(yán)重NEC的惡性循環(huán)特征是由細菌侵入、免疫激活、不受控制的炎癥產(chǎn)生活性氧和氮物質(zhì)、腸屏障失效共同造成的［2，12，19，24］。研究證明 IL-12、IL-10 對 NEC 損傷新生大鼠具有保護作用［25-26］。在一些研究中已經(jīng)顯示抗TNF-α療法能改善NEC［27-28］。MSCs在克羅恩病、放射性腸炎、移植物抗宿主病等諸多模型中均表現(xiàn)出明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)能力［8，10，29-30］。然而，既往文獻及本研究前期研究發(fā)現(xiàn)間MSCs這種抗炎及免疫調(diào)節(jié)能力需要在炎癥刺激、缺氧等條件下才得以產(chǎn)生［15，30］。綜上所述，MSC-CMNOR對炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)不明顯，而炎癥預(yù)激活MSC-CM可調(diào)控NEC小腸局部及系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)，抑制腸道炎性反應(yīng)。

表1 對照組、單純NEC損傷組、NEC損傷+MSC-CMNOR組、NEC損傷+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組大鼠血清中促炎因子與抑炎因子水平比較（x ±s，pg/g，n=10）Table 1 Comparison of mean levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory factors in rat serum samples from the control group，NEC injury group，NEC injury+MSC-CMNOR group and NEC injury+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO group

表2 對照組、單純NEC損傷組、NEC損傷+MSC-CMNOR組、NEC損傷+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO組新生大鼠小腸組織中促炎因子與抑炎因子水平比較（x ±s，pg/g，n=10）Table 2 Comparison of mean levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory factors in rat small intestine tissues from the control group，NEC injury group，NEC injury+MSC-CMNOR group and NEC injury+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO group

那么炎癥預(yù)激活MSC-CM調(diào)控NEC炎性反應(yīng)的作用機制如何？MSCs有很強的抗炎能力及可塑性，可通過本身對周圍微環(huán)境做出應(yīng)答，通過分泌抗炎因子、免疫抑制因子、生長調(diào)節(jié)因子等分子，直接參與炎性反應(yīng)過程，從而促進組織損傷修復(fù)［8-10］。與此同時，MSCCM可通過免疫調(diào)節(jié)因子間接作用于宿主免疫細胞、促進腸道干細胞增殖、分化［8，31］，可能也是其重要修復(fù)機制，但仍需進一步實驗證實。綜上所述，炎癥預(yù)激活MSC-CM可通過調(diào)節(jié)炎癥促進腸道黏膜的修復(fù)、改善NEC病情。下一步工作重點應(yīng)著手于MSCs對腸道微生物菌群、免疫細胞、腸道干細胞的調(diào)節(jié)，爭取為臨床診治NEC提供新的理論依據(jù)和途徑。

作者貢獻：朱小波進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，文章的可行性分析，文獻/資料收集、整理，撰寫論文；馬發(fā)鑫、馮琳、鄭躍進行論文的修訂，英文的修訂；沙衛(wèi)紅、陳浩負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)。

在本課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。