山東省部分地區(qū)豬偽狂犬病病毒分離鑒定及TK基因遺傳變異分析

古金元，劉照虎，馬梓承，李 焱，孟凡亮，王宏宇，肖一紅，劉思當

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安271018；2. 山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，泰安271018；3.山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，泰安 271018）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）又稱Aujeszky's disease（AD），是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的急性傳染病，豬是其天然貯存宿主[1]。當前，豬偽狂犬病在全世界廣泛流行，尤其是養(yǎng)殖密度較大的國家。PR可以造成種豬繁殖障礙，新生仔豬神經(jīng)癥狀以及急性死亡，生長豬以及育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀等，是目前威脅養(yǎng)豬業(yè)最主要的傳染病之一，每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成無法估量的經(jīng)濟損失[2,3]。

胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因，是一種由病毒基因組編碼的介導(dǎo)核酸代謝的酶類，主要決定著病毒的毒力強弱，是皰疹病毒中最早被發(fā)現(xiàn)的與毒力有關(guān)的基因，處于UL23區(qū)，基因全長963 bp，共編碼321個氨基酸。TK基因的主要功能是催化脫氧胸腺嘧啶核苷磷酸化成dTMP，并繼續(xù)磷酸化成DNA的基本成分dTTP。Kit等[4]率先確認了TK基因與PRV毒力有關(guān)。TK作為PRV重要的毒力基因之一，與病毒在機體神經(jīng)組織中的復(fù)制，長期處于潛伏感染和激活處于潛伏感染狀態(tài)的病毒粒子等過程關(guān)系密切，而與病毒在細胞內(nèi)的增殖關(guān)系不大[5-7]。TK基因的缺失不但能造成PRV毒力明顯下降甚至丟失，而且還可以大大減弱PRV在神經(jīng)組織中的復(fù)制能力，由外周神經(jīng)向腦傳播的能力以及導(dǎo)致宿主腦炎死亡的能力。另外，TK基因缺失后的病毒在細胞上的增殖能力與野毒株沒有顯著的差異，但毒力及潛伏感染的能力卻極大地減弱[8]。

2011年以前，基因缺失疫苗的普遍應(yīng)用，結(jié)合gE-ELISA鑒別診斷方法的運用, PR在我國得到了有效的控制。但自2011年下半年開始，我國部分省市使用PRV傳統(tǒng)疫苗免疫的豬群相繼暴發(fā)疑似偽狂犬病疫情，發(fā)病率和病死率明顯上升，并陸續(xù)分離得到病毒[9-15]。研究表明，分離毒株抗原性與傳統(tǒng)毒株相比發(fā)生顯著變異，PRV傳統(tǒng)疫苗免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，不能有效中和新分離病毒株，從而無法對豬形成完全的保護[14,16,17]。關(guān)于PRV變異毒株的分離報道越來越多，對其研究也日趨成為熱點。

為了解山東省部分地區(qū)免疫豬場PR流行情況，本研究對2018年1～5月份采集到的PR疑似病料進行了病毒分離鑒定，并對PRV分離毒株TK基因進行了序列測定及遺傳變異分析。

1 材料和方法

1.1 病料來源分別于2018年1～5月份在山東省濟寧市、聊城市、臨沂市、泰安市、德州市、淄博市等不同豬場，采集到10份PR疑似病料（腦組織、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體），這些豬場均使用PRV疫苗進行了常規(guī)免疫。

1.2 主要實驗材料pMD18-T Simple Vector、DL2000 DNA Marker、2×GC buffer、dNTP、rTaq酶、ddH2O購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；Easy Pure Viral RNA/DNA Extraction kit、DH5α感受態(tài)細胞、胎牛血清（FBS）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）購自天根試劑公司；瓊脂糖（Agarose）購自Sigma試劑公司；BHK-21細胞由本實驗室凍存。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中登錄的PRV TK全基因序列，使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計1對引物，用于TK全基因擴增和序列分析，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列見表1。

1.4 病原檢測將凍存于液氮中的病料組織解凍，取適量加入滅菌PBS研磨成勻漿，反復(fù)凍融3次后，9000×g離心3 min，然后取上清使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA Extraction kit（批號：K10314）提取病毒核酸。將提取的核酸為模板，用PRV TK引物進行PCR，然后將擴增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，最后在紫外凝膠成像儀下根據(jù)條帶位置判斷病原的感染情況。

表1 PRV TK基因引物序列Table 1 Primer sequence of PRV TK gene

1.5 病毒分離及PRV TK基因序列分析將經(jīng)過PCR鑒定為PRV TK陽性的病料勻漿液上清經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，接種于密度約70%的單層BHK-21細胞，盲傳3代后收毒，將細胞及上清按上述方法提取核酸后，進行PCR鑒定。將鑒定為陽性的核酸利用PRV TK引物，進行TK基因全長的擴增。將擴增產(chǎn)物進行膠回收，連接pMD 18-T載體后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞進行增菌培養(yǎng)，最后將鑒定為TK基因陽性的菌液送到上海生工生物公司測序。利用DNAStar 7.1軟件對本研究中分離到的毒株和GenBank中錄入的PRV參考毒株的TK基因進行核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列的比對分析，以便得出分離毒株的序列特征。同時構(gòu)建TK基因遺傳進化樹，比較分離株與參考株親緣關(guān)系的遠近。本研究所用到的GenBank收錄的13株參考毒株見表2。

表2 本研究序列分析所用參考毒株Table 2 PRV reference strains used for comparison in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 PR疑似病料病原檢測結(jié)果對10份來自山東省不同地區(qū)的PR疑似病料用PRV TK引物進行PCR擴增，結(jié)果全部為陽性。

2.2 病毒的分離鑒定10份PRV TK陽性病料勻漿液上清經(jīng)0.22μm濾器過濾后，接種于長滿單層的BHK-21細胞，其中7份可見典型的PRV細胞病變，以細胞圓縮、聚集和脫落為主要特征。盲傳3代后收毒，經(jīng)PCR鑒定全部為PRV陽性。將7株P(guān)RV分別命名為SDDZ、SDHZ、SDJN、SDLC、SDLY、SDTA、SDZB。

2.3 TK基因的擴增及同源性分析TK基因擴增結(jié)果表明，7株P(guān)RV分離株TK基因全長均為963 bp。同源性分析結(jié)果顯示，分離株之間TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為99.1%～99.8%和98.7%～99.4%，與參考毒株TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為97.8%～99.9%和97.2%～99.7%，并且7株分離株與國內(nèi)報道的PRV變異株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均略高于歐美毒株。分離株與參考毒株TK基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的同源性結(jié)果見表3。

2.4 PRV TK基因核苷酸及氨基酸序列分析使用DNAStar軟件的MegAlign功能，對7株P(guān)RV分離株TK基因與國內(nèi)變異株及歐美參考株Kaplan（JF797218）、Becker（JF797218）等進行分析比較，發(fā)現(xiàn)分離株及國內(nèi)變異株與歐美參考株相比，有一個共同的規(guī)律，即在堿基第644-645位由AC突變?yōu)镚T(圖1A)，導(dǎo)致其氨基酸第215位由蘇氨酸（T）突變?yōu)槔i氨酸（V）(圖1B)，結(jié)果表明7株分離株均應(yīng)屬于PRV變異毒株。

表3 分離株與各參考毒株TK基因核苷酸(nt)及推導(dǎo)氨基酸(aa)序列的相似度Table 3 Nucleotide and amino acid similarities of TK gene between isolates and reference strains

圖1 PRV TK基因核苷酸（A）及氨基酸(B)分析比較Fig.1 Analysis and comparison of nucleotide （A）and amino acid (B) of TK gene

2.5 PRV TK基因的遺傳進化分析將獲得的7株P(guān)RV毒株的TK基因與GenBank已發(fā)表的13株參考毒株的TK基因進行核苷酸序列比對，利用MEGA6的Maximum-Likelihood方法構(gòu)建進化樹，結(jié)果見圖2。

本研究分離到的7株毒株（標識）TK基因分別與國內(nèi)之前報道的JS-2012、HeN2012、TJ2012以及ZMD2012等變異株（標識）位于兩個相對獨立的分支上，親緣關(guān)系較近，而都與NIA3、Becker等歐美毒株以及疫苗株Hungary 2011（Bartha-K61株）（標識）的遺傳距離較遠。因此，我們推測目前山東省流行的PRV以變異毒株為主。當前國內(nèi)關(guān)于PRV新流行毒株變異主要有3種觀點：毒力增強說、抗原變異說以及毒力增強兼抗原變異說[18,19]。本研究中7株P(guān)RV變異株均分離自使用PRV傳統(tǒng)疫苗常規(guī)免疫的豬場，表明目前廣泛應(yīng)用的疫苗株對PRV變異株的攻擊已不能提供完全保護，這與之前國內(nèi)很多研究報道的結(jié)論相一致：2011年之后PR的流行歸結(jié)于PRV變異毒株的流行，而疫苗株無法提供有效保護[20-24]，但也有研究結(jié)果與之相悖[25]。

圖2 分離株與參考株TK基因遺傳進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of the nucleotide sequences of PRV isolates based on the TK gene