黑果枸杞抗氧化能力評價及比較研究

尹民強，吳金龍，王天琦，余瓊衛(wèi)，馬兆成*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院，園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北武漢 430070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450004；3.武漢大學化學與分子科學學院，生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室，湖北武漢 430072）

氧化損傷是導致衰老、炎癥、腫瘤、老年癡呆、糖尿病、免疫性疾病及心腦血管疾病的重要原因。目前，多種人工合成抗氧化劑和天然抗氧化劑已被用于抗氧化研究中[1-4]。其中，黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）、寧夏紅枸杞（Lycium barbarumL.）、藍莓（Vaccinium Spp）、黑醋栗（Ribes nigrumL.）、黑葡萄（Vitis viniferaL.）及桑葚（Morus albaL.）由于自身含有豐富的多糖、維生素、花青素、類黃酮等多種抗氧化活性物質(zhì)[5-8]，有很高的保健及藥用價值多用作天然抗氧化劑[9-13]。目前，已有大量對上述物質(zhì)單一品種的抗氧化活性評價研究，但多個品種的抗氧化活性系統(tǒng)評價及比較的研究較為鮮見。鑒于此，本研究以青海黑果枸杞為試驗對象，選擇寧夏黑果枸杞、寧夏紅枸杞、黑醋栗干、吐魯番黑加侖葡萄干、藍莓干及桑葚干為對照，對它們的抗氧化能力進行了系統(tǒng)評價及比較分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

本試驗選擇了市場上7 種不同的干果材料，分別是黑果枸杞1（青海）、黑果枸杞2（寧夏）、寧夏紅枸杞（銀川）、桑葚干（山東）、黑醋栗干果（黑龍江）、吐魯番黑加侖葡萄干（新疆）、野生藍莓果（黑龍江）若干。

1.1.2 試劑及儀器

BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，PBS 溶液，生理鹽水，ASPEN 公司；羥自由基測試試劑盒，總抗氧化能力（TAOC）測試盒（ABTS 法），總抗氧化能力（T-AOC）測試盒（FRAP 法），抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；DR-200Bs 酶標儀，Diatek 公司；TGL-16c 臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；TGL-16冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器；IMS-20 制冰機，常熟市雪科電器有限公司；HH-W-600 水浴鍋，金壇市江南儀器廠；FD-1A-50 冷凍干燥機，北京博醫(yī)康儀器有限公司；分光光度計、比色皿等。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

每個樣品準確稱取2 g，分別加入8 mL 的PBS，冰水浴條件下機械勻漿，以充分破碎細胞并釋放其中的抗氧化物，4 ℃、12 000 rpm/min 離心5 min，取上清液測定，用完置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 樣品中蛋白質(zhì)濃度測定

按照BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒方法，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒對樣品中蛋白濃度進行測定。配制工作液：根據(jù)蛋白標準品和樣品數(shù)量，按5 mL BCA 試劑A 加0.1 mL BCA 試劑B（50：1）配制適量BCA 工作液，充分混勻，并按照表1 將標準品稀釋至0.025～2 mg/mL。將25 μL 標準品和每種樣本的6 個重復分別加入96 孔板微孔中，在各孔中再加入200 μL BCA 工作液，充分混勻，37 ℃孵育30 min。冷卻至室溫，用酶標儀測定A562，根據(jù)標準曲線計算出蛋白質(zhì)濃度。

表1 蛋白質(zhì)標準樣品稀釋方法Table 1 Dilution method of protein standard sample

1.2.3 清除抑制羥自由基能力測定

使用羥自由基測試試劑盒對各個樣品的抑制羥自由基能力進行測定。取4 個5 mL 離心管，記為標準空白管、標準管、對照管和測定管，配置4 種溶液。配置方法如下，標準空白管：0.4 mL 蒸餾水；標準管：0.2 mL 蒸餾水+0.2 mL、0.03% H2O2，對照管：0.2 mL 蒸餾水+0.2 mL 底物應用液；測定管：0.2 mL 樣本溶液+0.2 mL 底物應用液。然后在所有管中加入0.4 mL 試劑3 應用液，混勻，37 ℃準確計時1 min（要求加完試劑3 就開始計時，每次一管），立即加入2 mL 顯色劑終止反應?；靹?，室溫放置20 min 后，在1 cm 光徑、550 nm 條件下，使用蒸餾水調(diào)零，然后測定各管吸光度（OD值）。清除自由基能力計算公式見式（1）。

式中，標準品濃度8.824 mmol/L，待測樣本蛋白濃度mgprot/mL，取樣量0.1 mL

1.2.4 總抗氧化能力測定

分別使用總抗氧化能力（T-AOC）測試盒（ABTS 法）和總抗氧化能力（T-AOC）測試盒（FRAP 法）對不同樣品的總抗氧能力進行測定。

ABTS 法：首先每種樣品重新準確稱取1 g，按質(zhì)量：體積=1：10(g：mL) 的比例，分別加入10 mL 的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，以充分破碎細胞并釋放其中的抗氧化物，4 ℃、12 000 rpm/min 離心5 min，取上清液測定。然后分別在空白孔、標準孔和測試孔中加入10 μL蒸餾水、10 μL 不同濃度的MTrolox 溶液（標準品Trolox溶液用蒸餾水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L 濃度制作標準曲線）和10 μL 待測樣品溶液。接著加入20 μL過氧化物酶與檢測緩沖液混合液（過氧化物酶與檢測緩沖液按1：9 的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配）和170 μL ABTS 工作液（按檢測緩沖液：ABTS 溶液：過氧化物應用液=76：5：4 的比例配制）。最后室溫反應6 min，在波長405 nm 下使用酶標儀讀取各孔OD值。并以標準品OD值為橫坐標，各OD值對應的標準品濃度為縱坐標制作標準曲線。

在采用Trolox 作為標準品進行總抗氧化能力檢測時，樣品的抗氧化能力可以用Trolox-Equivalent Anyioxidant Capacity（TEAC）來表示。提取后的溶液與某個摩爾濃度Trolox 的抑制率相同，計算時用該濃度下Trolox 的摩爾濃度另外除以提取物的蛋白濃度，最后以mmol/g 來表示。

FRAP 法：使用1.2.1 的樣品。首先配制不同濃度的標準品溶液：稱取27.8 mg 本試劑盒提供的FeSO4-7H2O，溶解并定容到1 mL，此時濃度為100 mmol/L，取適量100 mmol/L 的FeSO4-7H2O 溶液用蒸餾水將其稀釋到0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。接著分別在空白孔、標準孔及測定孔（每種樣品6 個重復）中加入5 μL 蒸餾水、5 μL 不同濃度的標準品溶液、5 μL 樣品溶液，最后都加入180 μL FRAP 工作液（試劑盒中將試劑1、2、3 以10：1：1 混勻充分，避光37 ℃孵育，現(xiàn)用現(xiàn)配），37 ℃孵育3～5 min，使用酶標儀讀取各孔在波長593 nm 下的OD值。并以標準品OD值為橫坐標，各OD值對應的標準品濃度為縱坐標制成標準曲線。

總抗氧化能力用FeSO4標準溶液的濃度來表示，如干果勻漿測定的OD值與3 mmol/L FeSO4的OD值相同，干果勻漿的蛋白濃度是1 mgprot/mL，干果勻漿的總抗氧化能力為3 (mmol/L)/(1 mg/mL)，即3 (mmol/L)/gprot。

1.2.5 抑制超氧陰離子能力測定

使用抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒（比色法）對樣品抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基能力進行測定。首先在對照管、標準管和測定管（每種樣品6 個重復）分別都加入1 mL 的試劑1，0.1 mL 的試劑2、試劑3 及試劑4。接下來在對照管中加入0.05 mL 蒸餾水，在標準管中加入0.05 mL、0.15 mg/mL 的VC 標準品，并在每支樣品管中加入0.05 mL 的樣品。用旋渦混勻器充分混勻，置于37 ℃恒溫水浴40 min，最后在每支管中加入2 mL顯色劑，混勻，10 min 后倒入1 cm 光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長550 mm 處比色。計算公式見式（2）。

式中，標準品濃度0.15 mg/mL，待測樣本蛋白濃度gpro/L。

1.2.6 黑果枸杞提取成分穩(wěn)定性考察

稱取黑果枸杞17 g 于小燒杯中，45 ℃下置于真空干燥箱中干燥72 h，然后置于研缽中，加入液氮磨碎成粉末，-20 ℃避光保存。

準確稱取50 mg 黑枸杞粉末于1.5 mL 離心管中，以1：15 的液料比加入750 μL、2%甲酸甲醇（即體積比甲酸：甲醇=2：98），室溫下避光浸提24 h。8 000 r/min 離心10 min，取上清液進入高效液相色譜（HPLC）檢測。

液相色譜條件：色譜柱為Pntulips SBP-C18（4.6 mm×250 mm＜i.d.＞，5 μm）。流動相A 為甲醇，B 為含0.5%甲酸水溶液。梯度淋洗程序，0～3 min：80%～70% B；3～13 min：70%～60% B；13～25 min：60%～50% B；25～35 min：50%B；35～40 min：50%～80%B；40～60 min：50%～80%B。流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為525 nm，進樣量為10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016 和Numbers（Apple）統(tǒng)計及處理數(shù)據(jù)，使用Graphpad Prism 7.0（GraPhpad Software）作圖。然后使用SPSS 25（IBM）進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干果羥自由基清除能力的對比

羥自由基氧化性極強，是造成組織脂質(zhì)過氧化、核酸斷裂和蛋白分解的主要原因，因此羥自由基的清除能力是衡量一種物質(zhì)抗氧化活性的重要指標[3，4]。表2 顯示了不同品種干果中的蛋白濃度和清除自由基能力，由表可以看出，試驗用各種干果均有不同的羥自由基清除能力，其中兩種黑果枸杞和野生藍莓果的羥自由基清除能力都達到了1.45 U/mgprot 以上，黑果枸杞1 的清除能力尤為突出，是所有測試品種中最高的，達到(1.620±0.114)U/mgprot。而同一屬的寧夏紅枸杞的羥自由基清除能力最弱。

表2 不同品種干果中的蛋白濃度和清除自由基能力Table 2 Protein concentration and free radical scavenging ability of different dried fruit

2.2 不同干果的抗超氧陰離子自由基能力對比

超氧陰離子和羥自由基一樣，都具有較高的化學反應活性，是造成氧脅迫的重要原因[5]。本研究對7 種干果的抗超氧陰離子自由基的能力進行了評價（見表2），由表可知，黑果枸杞2 的抗超氧陰離子能力最強，達到了(2.210±0.142) U/gprot，其次是野生藍莓果，達到了(1.968±0.100) U/gprot，然后是吐魯番黑加侖葡萄干、黑果枸杞1、黑醋栗干果和桑葚干，最弱的是寧夏紅枸杞。

2.3 不同干果的總抗氧化能力評價

通過ABTS 法和FRAP 法測定7 種干果的總抗氧化能力，結(jié)果如圖1 所示。其中ABTS 法測得的總抗氧化能力從高到低依次為黑果枸杞1＞黑醋栗干果＞吐魯番黑加侖葡萄干＞黑果枸杞2＞野生藍莓果＞寧夏紅枸杞＞桑葚干。而使用FRAP 法測得的總抗氧化能力與之有所不同，這7 種干果對Fe3+的還原能力依次是黑果枸杞1＞吐魯番黑加侖葡萄干＞黑果枸杞2＞野生藍莓果＞黑醋栗干果＞寧夏紅枸杞＞桑葚干。從以上結(jié)果不難看出，黑果枸杞1 的總抗氧化能力在7 種干果中是最強的，而寧夏紅枸杞和桑葚干是最弱的。

圖1 不同干果的總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of dried fruits

2.4 黑枸杞提取成分穩(wěn)定性測定

基于黑果枸杞1 的總抗氧化能力在7 種干果中最強，本文繼續(xù)分析了其提取溶液組成成分的色譜指紋圖譜，考察其穩(wěn)定性。以2%甲酸甲醇（即體積比甲酸：甲醇=2：98）為提取溶劑，將樣品分別放置0、2、4、6、8、10 h 后通過HPLC 法檢測黑枸杞提取液，得到黑枸杞的指紋圖譜，其穩(wěn)定性結(jié)果如圖2 所示。由圖中可知，黑枸杞的指紋圖譜沒有明顯變化，這說明黑枸杞提取物比較穩(wěn)定。

圖2 黑枸杞指紋圖譜穩(wěn)定性Fig.2 Fingerprint stability of Lycium ruthenicum Murr

3 結(jié)論

本研究測定了7 種干果羥自由基清除能力、抗超氧陰離子自由基能力及總抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7 種干果都有良好的抗氧化活性，但差異較大。其中青海黑果枸杞對ABTS 自由基和羥自由基的清除能力最強，而對超氧陰離子的清除能力不及寧夏黑果枸杞、野生藍莓果和吐魯番黑加侖葡萄干。在供試的7 種干果中，寧夏黑果枸杞清除超氧陰離子能力最強，但是清除羥自由基和ABTS 自由基的能力不如青海黑果枸杞。

試驗還發(fā)現(xiàn)不同方法測定所得的總抗氧化能力是不同的。在ABTS 測試中，總抗氧化能力為黑醋栗干果＞吐魯番黑加侖葡萄干＞寧夏黑果枸杞＞野生藍莓果。但在FRAP 測試中，總抗氧化活性能力對比則為吐魯番黑加侖葡萄干＞寧夏黑果枸杞＞野生藍莓果＞黑醋栗干果。兩者差異明顯，這說明不同的測定方法對總抗氧化能力的結(jié)果有較大影響。可見，為了更好地測定和評價抗氧化能力，建立一套完整的評價體系是必不可少的。

綜合4 種抗氧化能力的測定結(jié)果，可以得出，青海黑果枸杞在抑制羥自由基能力和總抗氧化能力方面都是最強的，說明青海黑果枸杞的抗氧化能力相對于其他干果來說十分突出，這可能是由于黑果枸杞中含有大量的花色苷，具有很高的藥用開發(fā)價值[14]。相反，寧夏紅枸杞和桑葚干是7 種干果中抗氧化能力最弱的。