精子DNA碎片對體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的影響

譚志國，孫健，張丹，馮娜，黃衛(wèi)東

(新疆佳音醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，烏魯木齊 830001)

在男性不育的檢查中，精液常規(guī)分析目前仍是評估男性不育的重要參考指標，但精液常規(guī)分析不能全面地反應精子的質(zhì)量和功能。在胚胎發(fā)育過程中，精子會向胚胎提供一半的遺傳物質(zhì)，其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的正常與否對精子的受精能力、胚胎的發(fā)育以及后期的臨床妊娠起著重要的作用[1]。精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation，SDF)是精子發(fā)生過程中產(chǎn)生的一種正常產(chǎn)物，含量在正常精子核遺傳物質(zhì)中所占比例較小，如果精子在發(fā)生過程中受到外界有害因素干擾，則會導致SDF的含量急劇增多，影響男性的生育能力[2]。精子DNA完整性的評估指標為DNA碎片指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)，本研究旨在研究接受輔助生殖治療夫婦的男性SDF程度對IVF-ET過程中受精、卵裂、胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象與分組

收集2016年10月至2018年12月在新疆佳音醫(yī)院生殖醫(yī)學中心進行輔助生殖治療的不育夫婦為研究對象，男女雙方排除輔助生殖禁忌證和染色體異常。納入標準：(1)女方年齡<37歲；(2)女方抗苗勒氏管激素(AMH)>1.1 ng/ml，取卵當日獲卵數(shù)>5個；(3)女方因輸卵管因素導致不孕；(4)最終助孕方案為IVF；(5)第3天移植日有新鮮卵裂期胚胎移植。排除標準：(1)男方精液檢查少精子癥、弱精子癥及畸形精子癥患者；(2)凍胚移植和新鮮囊胚移植病例。

共有1 041對夫婦(共1 041個周期)納入該研究，根據(jù)男方入院時生育力評估檢測的DFI值，將研究對象分為4組：DFI<10%組(n=277)、10%≤DFI<20%組(n=480)、20%≤DFI<30%組(n=183)及DFI≥30%組(n=101)。

二、研究方法

1.精液采集與分析：男方禁欲2～7 d，手淫法取精，待精液液化后，按世界衛(wèi)生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版標準進行觀察分析計數(shù)，根據(jù)計數(shù)的精液濃度，取一定量精液稀釋至100 μl，調(diào)整精子濃度為1～2×106個/ml。

2.精子DFI的檢測：采用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(sperm chromatin structure assay，SCSA)，精子DNA碎片檢測試劑盒由浙江星博生物科技有限公司提供，試劑盒組成包括：A液、B液、C1液、C2液(含吖啶橙)。在流式細胞儀(FACSCalibur，BD公司，英國)的進樣管中加入100 μl精液與A液的混合液后，加200 μl B液混勻，30 s后立即添加600 μl染色液(C1+C2液)混勻，上樣，系統(tǒng)數(shù)據(jù)收集5 000個精子自動停止，完成檢測。

3.精液處理方法：取卵當日精液處理方法為密度梯度離心加上游法，胚胎培養(yǎng)試劑及精液處理試劑均為SAGE公司商品化試劑，患者取卵當日手淫取精，精液于37℃培養(yǎng)箱中液化后，鏡下觀察并記錄精液常規(guī)，分別取80%梯度試劑和40%梯度試劑各1.5 ml，加入15 ml離心管內(nèi)使之形成界面清晰的兩層，再加入1.5～3.0 ml液化后的精液，100g離心20 min后，沉淀混勻后100g5 min離心2次，收集精子沉淀后于培養(yǎng)箱中上游待用。

4.IVF、胚胎觀察與移植：卵母細胞受精時間為絨毛膜促性腺激素(HCG)注射后約39 h，4 h后拆卵觀察是否有第二極體排出，次日晨觀察胚胎原核并進行原核評分，鏡下見原核確定受精。第3天進行胚胎觀察分級，正常受精即原核觀察時為2原核者；細胞數(shù)7個以上，卵裂球大小均勻，細胞碎片在0～10%之間為Ⅰ級胚胎，即優(yōu)質(zhì)胚胎。移植當日酌情選擇胚胎移植。

5.觀察指標：MⅡ卵率=MⅡ卵數(shù)/獲卵數(shù)×100%；受精率=(2原核卵母細胞數(shù)+1原核卵母細胞數(shù)+多原核卵母細胞數(shù)+未見原核卵裂卵母細胞數(shù))/IVF受精卵母細胞總數(shù)×100%；卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/受精卵母細胞數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、4組患者的基本情況比較

統(tǒng)計結(jié)果顯示，4組間的男性DFI值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DFI≥30%組女方年齡顯著高于DFI<10%組(P<0.05)；各組間的AMH值及胚胎移植數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、各組獲卵數(shù)及胚胎發(fā)育情況比較

不同研究組間，患者獲卵數(shù)、MⅡ卵率及卵裂率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；4組的受精率比較，10%≤DFI<20%組最低，顯著低于DFI<10%組和20%≤DFI<30%組(P<0.05)，但與DFI≥30%組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；優(yōu)質(zhì)胚胎率隨DFI升高而降低，DFI<10%組顯著高于10%≤DFI<20%組及DFI≥30%組(P<0.05)，與20%≤DFI<30%組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 各組患者基本情況比較(-±s)

表2 各組患者獲卵數(shù)及胚胎發(fā)育情況比較[(-±s)，%]

三、各組患者妊娠結(jié)局比較

統(tǒng)計結(jié)果表明，4組患者的臨床妊娠率及流產(chǎn)率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 各組患者妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

早在1999年，Evenson等[3]就提出利用SCSA檢測精液樣本對生育的預測作用，并認為對那些沒能獲得妊娠的夫婦而言，這是一個可利用的預測指標。目前，關于SDF的研究眾多，但不同的研究者采用不同的檢測方法，每種診斷方法的檢測目的不同，雖然一些診斷方法之間有一定的相關性，但仍缺乏明確的、有說服力的臨床參考值[4]，研究結(jié)果缺乏再現(xiàn)性[5]，使得SDF對胚胎受精、發(fā)育以及最終妊娠結(jié)局的影響一直存在爭議。Carlini等[6]在一項針對意大利反復流產(chǎn)夫婦的研究中，利用轉(zhuǎn)移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(Transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL)評估SDF，發(fā)現(xiàn)反復流產(chǎn)的夫婦中男性精液SDF值水平與不育組相似，明顯高于正常生育的對照組，但其認為不能單純以SDF作為反復流產(chǎn)風險的預測指標。Oleszczuk等[7]認為當DFI達到40%或更高時，流產(chǎn)率會明顯上升，精子DNA檢測可以作為選擇輔助生殖技術(ART)受精方式的方法，因為對于高DFI的患者，卵胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)可能是更好的治療方法。Kamkar等[8]采用SCSA法和TUNEL法檢測反復流產(chǎn)夫婦男性的SDF，同時檢測精液中自由基和抗氧化劑水平，認為精液的DFI、自由基和抗氧化劑水平與反復自然流產(chǎn)有明顯的相關性。Oehninger等[9]則認為，將DNA碎片分析作為主要的診斷和篩查工具為時尚早。但隨著研究的深入，相信隨著時間的推移以及更多數(shù)據(jù)的支持，研究者對于精子SDF的預測價值會有一個確定的結(jié)論[10]。

本研究顯示各組間女性患者獲卵數(shù)、MⅡ卵率比較無顯著性差異，10%≤DFI<20%組受精率最低，與DFI<10%組和20%≤DFI<30%組相比有顯著性差異，這與文獻中精子DFI值影響受精結(jié)果[11]、頂體酶活性[12]及精子透明質(zhì)酸結(jié)合能力[13]的結(jié)論相反，推測這可能與納入統(tǒng)計的數(shù)據(jù)量有關。Casanovas等[14]研究認為，即使DNA損傷不能在短時間內(nèi)修復，胚胎分裂亦可進行，所以各組間卵裂率無明顯差異，但雙鏈的損傷會延續(xù)，導致染色體碎片的拆分、重排或復雜重排。雖然本研究中DFI<10%組與20%≤DFI<30%組相比，優(yōu)胚率無明顯差異，這可能與納入研究的數(shù)據(jù)量有關，但各組間優(yōu)質(zhì)胚胎率隨著DFI的升高而降低。因為即使精子存在DNA損傷，也同樣能夠使卵母細胞受精，當損傷的DNA融合入胚胎的基因組后，會導致復制和轉(zhuǎn)錄錯誤，導致不同胚胎階段遺傳物質(zhì)的畸變[15]。雖然有研究認為SDF的升高會對妊娠結(jié)局產(chǎn)生不良影響[16]，但本研究顯示，各組間的臨床妊娠率和流產(chǎn)率無顯著性差異，這可能與移植時選擇優(yōu)質(zhì)胚胎及移植胚胎數(shù)有關，也可能與患者年齡較小有關。

本研究的局限在于影響男性精子DFI值的因素較多，如精索靜脈曲張[17]、超負荷的運動[18]、減肥[19]、禁欲時間[20]等，尤其是禁欲時間。Brandley等[21]認為，對于DFI高的患者，通過重復射精后再檢測其DFI值，可能會出現(xiàn)DFI值下降的現(xiàn)象。本研究并未對患者的禁欲時間進行比較，如果能在取卵當日明確其禁欲時間同時檢測其精液DFI值，就能更有效地證明DFI值與胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的關系。另外，本研究納入的研究對象為移植日有優(yōu)質(zhì)胚胎的人群，對于那些無優(yōu)質(zhì)胚胎移植的患者，是否存在更明顯的DFI值變化趨勢，仍需進一步研究。

綜上所述，本研究認為對于年齡小于37歲、接受IVF的女性患者，優(yōu)質(zhì)胚胎率會隨著DFI的升高而降低，而DFI對于臨床妊娠和流產(chǎn)尚未見明顯影響。但鑒于研究對象的納入和選擇限制，仍需要擴大樣本量，將研究人群和對象覆蓋的更廣泛，以期得到更可靠的研究結(jié)論。