103份馬鈴薯種質(zhì)資源的耐寒性評(píng)價(jià)

丁紅映 熊興耀， 王萬興 胡新喜 田宇豪 秦玉芝*

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部薯類作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

植物對(duì)低溫的適應(yīng)性受多基因調(diào)控，耐寒性評(píng)價(jià)從低溫脅迫下植物的表型特征、細(xì)胞生理生化變化、分子響應(yīng)等不同層面進(jìn)行（陳林波，2010；許英 等，2015），常見的評(píng)價(jià)方法有直接鑒定法和間接鑒定法兩類。直接鑒定法包括田間自然霜凍法、生長恢復(fù)法、人工氣候室法等（李文明 等，2017）。間接鑒定法主要有測(cè)定細(xì)胞膜電導(dǎo)率、氧化還原酶系統(tǒng)、可溶性糖含量、脯氨酸含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及NBT/DAB組織原位顯色等。其中，田間自然霜凍法、測(cè)定細(xì)胞膜電導(dǎo)率和生理生化指標(biāo)較為常見。魏亮（2012）采用電導(dǎo)率法和田間自然霜凍法評(píng)價(jià)了116 份馬鈴薯材料的耐寒性。楊慧菊和郭華春（2016）通過測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率、過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量和可溶性蛋白含量評(píng)價(jià)了10 個(gè)馬鈴薯品種的耐寒性。

植物耐寒性是數(shù)量遺傳性狀，單一指標(biāo)難以準(zhǔn)確地反映耐寒性的強(qiáng)弱，采用不同分析方法綜合衡量，可以增強(qiáng)評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性（楊慧菊和郭華春，2016）。應(yīng)用不同分析方法綜合評(píng)價(jià)植物的逆境耐受性已有諸多報(bào)道，如采用隸屬函數(shù)分析和聚類分析相結(jié)合的方法評(píng)價(jià)作物耐鹽性（穆志新 等，2017；李青 等，2018；牛遠(yuǎn) 等，2018；耿雷躍 等，2019）、耐高溫性（曾小玲 等，2010；朱朝輝 等，2011；韓瑞宏 等，2015；靳路真 等，2016）、抗旱性（謝小玉 等，2013；張慶華 等，2018；孫豐磊 等，2019）、耐低溫性（黃超 等，2018）等。

馬鈴薯喜冷涼但不耐霜凍，中國南方冬閑田是馬鈴薯“主糧化”目標(biāo)下開發(fā)的重點(diǎn)區(qū)域，該區(qū)域秋冬作馬鈴薯在生長期間容易遭受持續(xù)低溫以及霜凍危害，造成減產(chǎn)或絕收（熊興耀 等，2008）。利用科學(xué)的方法對(duì)馬鈴薯耐寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，提高馬鈴薯耐寒種質(zhì)篩選的準(zhǔn)確性，對(duì)于馬鈴薯耐寒育種研究以及區(qū)域生態(tài)強(qiáng)適應(yīng)型品種培育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試103 份馬鈴薯材料從中國馬鈴薯資源庫、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院、國際馬鈴薯中心（CIP）亞太中心（中國）、美國威斯康星州馬鈴薯種質(zhì)庫（USDA）等單位引進(jìn)，材料編號(hào)、名稱、來源及選育區(qū)域詳見表1。

表1 供試馬鈴薯材料的編號(hào)、名稱、來源及選育區(qū)域

續(xù)表

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 電導(dǎo)率法 2018 年9 月初在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯工程中心組培室進(jìn)行組培苗擴(kuò)繁，每份材料5 瓶，每瓶5～6 株，光照強(qiáng)度為3 200 lx，光周期為14 h/10 h（光照/黑暗，下同），溫度為20～22 ℃，生長25 d 后移栽于人工氣候室，光照強(qiáng)度為5 500 lx，光周期為14 h/10 h，溫度為20～22 ℃，生長50 d 后取功能葉片（以倒數(shù)第3、4 節(jié)位的葉片最佳）1～2 片測(cè)定電導(dǎo)率。

電導(dǎo)率的測(cè)定參照李飛等（2008）的方法略作改動(dòng)：將功能葉片用蒸餾水反復(fù)沖洗并吸干葉片表面水分，放入50 mL 帶蓋的離心管中，封口后置于程序降溫儀內(nèi)，初始溫度為0 ℃，保持30 min，在離心管底部加入少許冰塊，繼續(xù)保持30 min 后，溫度由0 ℃降至-1 ℃，處理1 h 后取樣，溫度由-1℃降至-2 ℃，處理1 h 后取樣，以此類推，直至溫度降至-7 ℃。每次取樣后，將離心管放在冰上解凍；將解凍葉片剪成1.5 mm 左右的條形，盡量避開主脈，稱取0.1 g，加入10 mL 去離子水，充分浸泡，設(shè)3 次重復(fù)。12 h 后搖勻，測(cè)定電導(dǎo)率R1，在100℃水浴鍋中煮沸20 min，冷卻至室溫，搖勻，測(cè)定電導(dǎo)率R2。電解質(zhì)滲出率=R1/R2×100%，求出3 次電解質(zhì)滲透率的平均值，用Logistic 方程擬合。電解質(zhì)滲透率與低溫處理溫度之間遵循Logistic 方程的變化規(guī)律，用曲線拐點(diǎn)表示各馬鈴薯品種的半致死溫度（丁旭 等，2017）。

1.2.2 田間自然霜凍法 2018 年10 月10 日在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯工程中心組培室進(jìn)行組培苗擴(kuò)繁，每份材料5 瓶，每瓶5～6 株，光照強(qiáng)度為3 200 lx，光周期為14 h/10 h，溫度為20～22 ℃，生長30 d 后于11 月10 日移栽至室外，每份材料種植3盆，每盆4～5 株，3 次重復(fù)。2018 年12 月中旬至2019 年1 月中旬，湖南長沙地區(qū)霜凍和冰雪等寒冷天氣符合馬鈴薯生長期間自然霜凍評(píng)價(jià)條件。

田間自然霜凍法根據(jù)葉片的顏色、水漬斑以及莖稈的透明度來評(píng)價(jià)植物的抗凍性，植物受凍害程度越低，說明耐寒性越強(qiáng)（李文明 等，2017）。Vega 和Bamberg（1995）、Chen 等（1999）將植物的凍害情況劃分為7 個(gè)等級(jí)：0 級(jí)，沒有損傷；1 級(jí)，頂葉受到輕微傷害；2 級(jí)，頂葉少部分凍死；3 級(jí)，大多數(shù)頂葉凍死；4 級(jí)，所有頂葉及葉柄凍死；5 級(jí)，所有葉片凍死；6 級(jí)，整株凍死。

1.3 主要儀器

試驗(yàn)用儀器包括程序降溫儀、DDSJ-308A 型電導(dǎo)率儀、天平、50 mL 離心管、水浴鍋等。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2010 軟件，聚類分析、半致死溫度計(jì)算采用SPSS 22.0 軟件。

1.4.1 隸屬函數(shù)分析 耐寒系數(shù)和隸屬函數(shù)計(jì)算參考謝季堅(jiān)和劉承平（2005）、楊金紅（2007）的方法。

耐寒系數(shù)=處理測(cè)量值/對(duì)照測(cè)量值×100% ①

隸屬函數(shù)值u（Xij）=（Xij-Xmin）/（Xmax-Xmin） ②

反隸屬函數(shù)值u（Xij）=1-（Xij-Xmin）/（Xmax-Xmin） ③

其中，u（Xij）為第i個(gè)品種第j個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，Xij為耐寒系數(shù)，Xmin為所有供試材料中第j個(gè)指標(biāo)耐寒系數(shù)的最小值，Xmax為所有供試材料中第j個(gè)指標(biāo)耐寒系數(shù)的最大值。如果耐寒指標(biāo)與耐寒程度呈正相關(guān)，用公式②計(jì)算，反之用公式③計(jì)算。

1.4.2 耐寒性鑒定標(biāo)準(zhǔn) 采用隸屬函數(shù)法對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行耐寒性排序，隸屬函數(shù)度參考張文娥等（2007）的方法。0.70≤u（Xij）≤1.00 為高耐，劃為Ⅰ級(jí)；0.60≤u（Xij）≤0.69 為耐寒，劃為Ⅱ級(jí)；0.40≤u（Xij）≤0.59 為中耐，劃為Ⅲ級(jí)；0.30≤u（Xij）≤0.39 為低耐，劃為Ⅳ級(jí)；0≤u（Xij）≤0.29 為不耐，劃為Ⅴ級(jí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 103 份馬鈴薯種質(zhì)資源耐寒性隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)結(jié)果

2018 年12 月28 日至2019 年1 月3 日，湖南長沙地區(qū)遭遇連續(xù)6 d 低溫天氣，最低溫度在0 ℃以下，形成了很好的自然霜凍評(píng)價(jià)條件。12 月31日至翌年1 月1 日降雪，待雪融化后，1 月3 日對(duì)103 份馬鈴薯種質(zhì)資源耐寒性進(jìn)行田間自然霜凍法評(píng)價(jià)（圖1）。隨著氣溫的恢復(fù)，1 月20 日再次統(tǒng)計(jì)了馬鈴薯種質(zhì)資源的耐寒等級(jí)，與1 月3 日的結(jié)果基本一致。

圖1 田間自然霜凍條件下部分馬鈴薯種質(zhì)資源的耐寒性評(píng)價(jià)

根據(jù)公式③和1.5.2 的耐寒性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，采用隸屬函數(shù)法對(duì)半致死溫度和霜凍表型分級(jí)的兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析。如表2 所示，半致死溫度隸屬函數(shù)值劃分為Ⅰ級(jí)〔0.7≤u（Xij）≤1.0〕的有16 份材料，屬于高耐，占供試材料的15.5%；Ⅱ級(jí)〔0.60≤u（Xij）≤0.69〕有6 份材料，屬于耐寒，占供試材料的5.8%；Ⅲ級(jí)〔0.40≤u（Xij）≤0.59〕有39份材料，屬于中耐，占供試材料的37.9%；Ⅳ級(jí)〔0.30≤u（Xij）≤0.49〕有21 份材料，屬于低耐，占供試材料的20.4%；Ⅴ級(jí)〔0≤u（Xij）≤0.29〕有21 份材料，屬于不耐，占供試材料的20.4%。

霜凍表型分級(jí)隸屬函數(shù)值劃分為Ⅰ級(jí)的有17份材料，屬于高耐，占供試材料的16.5%；Ⅱ級(jí)有8 份材料，屬于耐寒，占供試材料的7.8%；Ⅲ級(jí)有20 份材料，屬于中耐，占供試材料的19.4%；Ⅳ級(jí)有10 份材料，屬于低耐，占供試材料的9.7%；Ⅴ級(jí)有48 份材料，屬于不耐，占供試材料的46.6%。

表2 103 份馬鈴薯種質(zhì)資源耐寒性隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)結(jié)果

續(xù)表

通過上述分析，采用電導(dǎo)率法和田間自然霜凍法評(píng)價(jià)的隸屬函數(shù)值為Ⅰ級(jí)（高耐）的分別占15.5%和16.5%，兩者僅相差1 個(gè)百分點(diǎn)，Ⅱ級(jí)（耐寒）分別占5.8%和7.8%，兩者相差2.0 個(gè)百分點(diǎn)，但是Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級(jí)的占比差異較大。電導(dǎo)率法的Ⅲ級(jí)（中耐）、Ⅳ級(jí)（低耐）、Ⅴ級(jí)（不耐）占比分別為37.9%、20.4%、20.4%；而田間自然霜凍法分別為19.4%、9.7%、46.6%，Ⅴ級(jí)（不耐）占比擴(kuò)大，其他等級(jí)的比例縮小。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是在田間自然霜凍法評(píng)價(jià)的過程中，溫度和時(shí)間無法人為控制，持續(xù)的低溫脅迫將大多數(shù)中間抗性材料歸為Ⅴ級(jí)，即耐寒性最差的一類。

2.2 103 份馬鈴薯種質(zhì)資源耐寒性聚類分析結(jié)果

將103 份馬鈴薯材料的半致死溫度進(jìn)行聚類分析（表3、圖2），得到58 份不耐寒和低耐寒材料，占供試材料的56.3%；29 份中耐寒材料，占供試材料的28.2%；16 份耐寒和高耐寒材料，占供試材料的15.5%。霜凍表型分級(jí)聚類分析（表3、圖3）得到61 份不耐寒和低耐寒材料，占供試材料的59.2%；19 份中耐寒材料，占供試材料的18.4%；23 份耐寒和高耐寒材料，占供試材料的22.3%。電導(dǎo)率擬合方程分析材料的半致死溫度（LT50）與霜凍表型分級(jí)結(jié)果呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.747，表明電導(dǎo)率法鑒定的結(jié)果真實(shí)可信，與馬鈴薯材料在田間低溫霜凍環(huán)境下存活情況高度一致。兩種方法的聚類分析結(jié)果相差不大，但是從品種來看，華恩1 號(hào)（半致死溫度聚類為1 類，霜凍表型分級(jí)聚類為3 類）、中薯17 號(hào)（半致死溫度聚類為1 類，霜凍表型分級(jí)聚類為3 類）的跨度較大，其他材料的聚類跨度較小。

表3 103 份馬鈴薯種質(zhì)資源耐寒性聚類分析結(jié)果

圖2 半致死溫度聚類分析

圖3 霜凍表型分級(jí)聚類分析

2.3 不同來源的馬鈴薯種質(zhì)資源耐寒性比較

采用隸屬函數(shù)法和聚類分析法比較103 份不同來源的馬鈴薯種質(zhì)資源的耐寒性，如表4 所示，隸屬函數(shù)法的鑒定結(jié)果是，采用半致死溫度和霜凍表型分級(jí)評(píng)價(jià)的中等以上耐寒性資源分別占供試材料的21.36%和24.27%，國外引入材料分別占28.13%和28.13%，國內(nèi)材料分別占18.31%和22.54%；中等耐寒性資源分別占供試材料的37.86%和19.42%，國外引入材料分別占40.63%和31.25%，國內(nèi)材料分別占36.43%和14.08%；敏感資源分別占供試材料的40.78%和56.31%，國外引入材料分別占31.25%和40.62%，國內(nèi)材料分別占45.07%和63.38%。

聚類分析法的鑒定結(jié)果是，采用半致死溫度和霜凍表型分級(jí)評(píng)價(jià)的1 類資源分別占供試材料的56.31%和59.22%，國外引入材料分別占43.75%和43.75%，國內(nèi)材料分別占61.97%和66.22%。2類資源分別占供試材料的28.16%和18.45%，國外引入材料分別占34.37%和28.13%，國內(nèi)材料分別占25.35%和14.08%。3 類資源分別占供試材料的15.53%和22.33%，國外引入材料分別占21.88%和28.13%，國內(nèi)材料分別占12.68%和19.72%。

表4 103 份不同來源的馬鈴薯種質(zhì)資源耐寒性比較

隸屬函數(shù)法和聚類分析法的結(jié)果均表明國外引入種質(zhì)資源的耐寒性強(qiáng)于國內(nèi)，國內(nèi)種質(zhì)資源中北方一作區(qū)的耐寒性強(qiáng)于西南混合區(qū)。湖南馬鈴薯工程技術(shù)研究中心以耐低溫性強(qiáng)為目標(biāo)引入國外材料是國外材料耐寒性整體偏高的主要原因；另外，北方一作區(qū)為我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，選育的馬鈴薯品種類型豐富，適應(yīng)性廣，因此從優(yōu)勢(shì)區(qū)域引進(jìn)馬鈴薯資源，進(jìn)行冬作生態(tài)環(huán)境強(qiáng)適應(yīng)型品種篩選始終是南方馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的有效措施。

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯作為世界范圍內(nèi)主要的糧食作物之一，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的地位。目前在馬鈴薯普通栽培種中沒有發(fā)現(xiàn)耐寒性較好的資源，但野生種在長期的進(jìn)化和適應(yīng)過程中產(chǎn)生了諸多的變異類型，形成了抗逆性強(qiáng)特異品種性狀豐富等特點(diǎn)，所以對(duì)包括野生種在內(nèi)的耐寒種質(zhì)資源進(jìn)行挖掘，是拓展馬鈴薯抗性遺傳背景的有效手段（康黎，2017）。國際上馬鈴薯耐寒性研究起步較早，電導(dǎo)率分析法和田間自然霜凍法也是國內(nèi)外學(xué)者普遍使用的方法。電導(dǎo)率法技術(shù)完善，不受季節(jié)的限制，應(yīng)用較廣泛，在獼猴桃（楊超英 等，2014）、小麥（趙瑞玲 等，2019）、櫻桃（任惠 等，2016）等抗寒性研究中取得較好效果，但是該方法操作繁瑣，周期長，對(duì)測(cè)試葉片的生長一致性要求高，重復(fù)性不好，大批量材料的篩選受到限制（魏亮，2012）。田間自然霜凍法的分級(jí)細(xì)致合理，結(jié)果可靠，適合大批量的供試材料篩選，但該方法周期性長，受季節(jié)的限制，冰（霜）凍程度和時(shí)間不可控制。另外，采用單一指標(biāo)很難用于機(jī)理十分復(fù)雜的耐寒性分析，本試驗(yàn)在測(cè)定2 個(gè)指標(biāo)的基礎(chǔ)上，引入科學(xué)的分析方法，為綜合評(píng)價(jià)馬鈴薯耐寒性資源提供了新的思路。

本試驗(yàn)采用電導(dǎo)率法和田間自然霜凍法的兩個(gè)指標(biāo)，綜合隸屬函數(shù)分析法和聚類分析法評(píng)價(jià)了103 份馬鈴薯資源的耐寒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯普通栽培種具有一定耐寒性的大多數(shù)材料半致死溫度在-2.11～-0.72 ℃之間（半致死溫度聚類在第1類，材料58 份，占比56.3%），田間自然霜凍評(píng)價(jià)等級(jí)在3.8～6.0 級(jí)之間（霜凍表型分級(jí)聚類在第1類，材料61 份，占比59.2%），本試驗(yàn)對(duì)馬鈴薯普通栽培種的耐寒性分級(jí)與前人的研究結(jié)果一致（魏亮 等，2017）。隸屬函數(shù)法對(duì)田間自然霜凍等級(jí)評(píng)價(jià)的中等以上耐寒材料、中等耐寒材料、敏感材料所占比例分別是24.27%、19.42%、56.31%，而聚類分析法對(duì)田間自然霜凍等級(jí)評(píng)價(jià)的3 類、2 類、1 類所占比例分別是22.33%、18.45%、59.22%，兩種方法差值的絕對(duì)值分別是0.97%、0.97%、2.91%，說明半致死溫度和霜凍表型分級(jí)鑒定結(jié)合隸屬函數(shù)法和聚類分析法能夠有效評(píng)價(jià)馬鈴薯種質(zhì)資源的耐寒性。

綜合電導(dǎo)率法和田間自然霜凍法評(píng)價(jià)結(jié)果，本試驗(yàn)得到Anti-10、隴薯5 號(hào)、Sten-1、中薯10 號(hào)、389746.2、龍薯4 號(hào)、Lxs-4、l0004-12、中薯12號(hào)、春薯1 號(hào)、冀張14 號(hào)、中薯170 號(hào)、Vio-9、紅美、中薯4 號(hào)、10-14、01-44、新大坪、中薯8 號(hào)、中薯3 號(hào)、GS397 等21 份不耐寒材料，半致死溫度在-1.58～-0.72 ℃之間，評(píng)價(jià)等級(jí)為4～6 級(jí)。同時(shí)得到Funday、AV9、BS214、396034.268、狗頭山藥、臨薯3 號(hào)、烏蒙684、康薯53、CBADG-16X、河壩洋芋、ФИΤΟФΤΟΡΟy СΤΟЙЧИВЫЙ、中薯2 號(hào)、F170 F171、acancle-4、CBADG-13X、GS393 等16 份耐寒性較好的材料，半致死溫度在-3.80～-2.90 ℃之間，霜凍表型分級(jí)為0.20～2.00級(jí)，其中，GS393 耐寒性最強(qiáng)，半致死溫度為-3.8℃，霜凍表型分級(jí)為0.20 級(jí)。