轉(zhuǎn)mapk雙鏈RNA 表達(dá)載體黃瓜對(duì)土壤線蟲多樣性的影響

趙曉曼 趙松宇 孫婷婷 田雪亮* 弭寶彬

（1 河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，1996 年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積為170 萬(wàn)hm2，到2000 年增至4 420 萬(wàn)hm2，2016年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積就達(dá)1.851 億hm2，比1996 年增加了110 倍。2016 年耐除草劑作物種植面積為8 650 萬(wàn)hm2，約占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的47%，抗蟲轉(zhuǎn)基因作物約占12%（Clive，2016）。隨著轉(zhuǎn)基因作物大面積種植，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和人類健康的潛在安全性問(wèn)題日益關(guān)注（劉迎哲，2017；黃錦華 等，2018），開(kāi)展了眾多研究。目前，大量研究集中在轉(zhuǎn)Bt 蛋白基因作物的環(huán)境安全性，也就是轉(zhuǎn)基因作物對(duì)天敵昆蟲和土壤微生物的影響，如細(xì)菌、真菌、土壤線蟲等（陳彥君，2017；梁晉剛和張秀杰，2017；邱良妙 等，2018；周霞 等，2018）。土壤線蟲種類多樣，數(shù)量豐富，廣泛分布于各類土壤中，是土壤生物中十分重要的類群。據(jù)估計(jì)目前已知土壤線蟲數(shù)量占地球線蟲總數(shù)量的35%（Andrassy，1992），它們?cè)谕寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)中占有多個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)，與其他土壤生物構(gòu)成食物網(wǎng)，對(duì)土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)起著重要的作用，因此土壤線蟲在指示土壤食物網(wǎng)總體情況及土壤生態(tài)功能方面具備較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)（Bongers，1990），在評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全性方面也被廣泛應(yīng)用。Griffiths 等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因玉米土壤線蟲數(shù)量與親本玉米相比表現(xiàn)出顯著的短暫降低。李修強(qiáng)等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因水稻土壤線蟲數(shù)量與親本相比無(wú)明顯差異。風(fēng)春等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因棉花對(duì)土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)和種類組成的影響不顯著。上述研究主要針對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)土壤線蟲的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，而對(duì)其他類型的轉(zhuǎn)基因作物安全性的研究較少。

促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein，MAPK）廣泛存在于真核生物中，是一類高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，在病原物誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用（馬曼莉，2018）。根結(jié)線蟲是嚴(yán)重危害番茄、黃瓜等蔬菜作物的土傳性病害，其防治方法包括抗性品種利用、化學(xué)防控、物理防控及生物防控等。轉(zhuǎn)mapk雙鏈RNA表達(dá)載體黃瓜能夠抑制根結(jié)線蟲對(duì)黃瓜根系的侵染，對(duì)土壤真菌、古菌、細(xì)菌未產(chǎn)生顯著影響（陳國(guó)華 等，2013；弭寶彬 等，2013；弭寶彬，2013）。但轉(zhuǎn)mapk雙鏈RNA 表達(dá)載體作用靶標(biāo)為根結(jié)線蟲的MAPK 激酶，而土壤線蟲也存在類似基因，轉(zhuǎn)mapk基因是否對(duì)土壤線蟲具有影響有待研究。

鑒于此，本試驗(yàn)以轉(zhuǎn)mapk雙鏈RNA 表達(dá)載體黃瓜為對(duì)象，分析轉(zhuǎn)基因黃瓜對(duì)土壤線蟲多樣性的影響，以期為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因黃瓜的生態(tài)安全性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及供試材料

試驗(yàn)田位于北京順義溫室基地。轉(zhuǎn)基因黃瓜材料來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，含有Mi mpk1基因片段的雙鏈RNA 表達(dá)載體。該基因片段來(lái)自南方根結(jié)線蟲，GenBank 登錄號(hào)為DQ923592。以非轉(zhuǎn)基因黃瓜（Cucumis sativusL.）材料（品種代號(hào)9930）為對(duì)照。轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜材料在同一溫室連續(xù)種植3 a（2015～2018年），每年種植兩茬，春茬黃瓜生長(zhǎng)期為4～6 月；秋茬黃瓜生長(zhǎng)期為8～10 月。轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜材料按壟間隔種植，各材料種植50 壟，每壟40 株，兩種材料的種植面積分別為200 m2。每種材料3 次重復(fù)。黃瓜生長(zhǎng)期間按正常農(nóng)事操作管理。為了防止轉(zhuǎn)基因材料擴(kuò)散，溫室設(shè)置防蟲網(wǎng)，專人管理。

1.2 土壤取樣方法

于第3 年6 月中旬取黃瓜根際土壤樣品，轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜材料分別選5 壟作為5 個(gè)取樣點(diǎn)。每個(gè)取樣點(diǎn)選擇10 株黃瓜，用土壤采樣器采集距離根部5 cm 處土壤，取樣深度 0～15 cm。10 株黃瓜根際土壤混入一個(gè)密封袋，作為一個(gè)樣點(diǎn)的土壤樣品。每個(gè)材料共計(jì)取5 個(gè)樣點(diǎn)，即5 次重復(fù)，帶回實(shí)驗(yàn)室，分離土壤線蟲。

1.3 土壤線蟲收集

土壤線蟲收集采用淺盤法：將塑料筐放入平底托盤，單層面巾紙平鋪于塑料筐底。稱取200 g 土壤樣品置于面巾紙上，在平底托盤中加入自來(lái)水，確保水面浸沒(méi)土壤，靜置過(guò)夜16 h 以上，然后收集平底托盤水中的土壤線蟲，離心棄上清液，富集土壤線蟲后置于4 ℃冰箱保存。

1.4 土壤線蟲DNA 的提取

為了排除土壤腐殖酸對(duì)下游試驗(yàn)的影響，采用土壤微生物DNA 提取試劑盒（MP Biomedicals FastDNA kit，American）提取土壤線蟲DNA，具體流程參考說(shuō)明書。提取的土壤線蟲DNA 經(jīng)檢測(cè)合格后，保存于-20 ℃ 冰箱。

1.5 線蟲18S rDNA 基因克隆文庫(kù)構(gòu)建

以18S rDNA 基因片段作為土壤線蟲的marker 基因，引物為MN18F（5′-CGCG AATRGCTCATTACAACAGC-3′）和22R（5′-GCCT GCTGCCTTCCTTGGA-3′）（Waite et al.，2003），目的片段約900 bp。PCR 反應(yīng)體系25 μL：1.5 μL DNA 模板，1 μmol·L-1上下游引物，0.5 mmol·L-1dNTPs，2 μL EasyTaqDNA 聚合酶、1×反應(yīng)緩沖液，20 μL ddH2O。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，純化，連接入pEASY-T5 載體（北京百邁克生物技術(shù)有限公司），轉(zhuǎn)化Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞（北京百邁克生物技術(shù)有限公司），涂布LB 平板（氨芐青霉素50 μg·mL-1），過(guò)夜后隨機(jī)挑取200 個(gè)陽(yáng)性克隆培養(yǎng)于LB 液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素50 μg·mL-1）中振蕩培養(yǎng)8 h，將克隆送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲各構(gòu)建3 個(gè)文庫(kù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Chimera Check 軟件對(duì)土壤線蟲18S rDNA 基因序列進(jìn)行過(guò)濾去雜，去除嵌合體序列。用DOTUR 軟件包對(duì)土壤線蟲18S rDNA 序列劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），設(shè)定閾值為97%。將每個(gè)OTU 代表序列在NCBI進(jìn)行BLAST 比對(duì)，鑒定土壤線蟲的物種信息。依據(jù)各線蟲比例，計(jì)算Shannon 和Simpson 指數(shù)（海棠 等，2008）。

Shannon 指數(shù)H=-∑PilnPi

Simpson 指數(shù)D=1-∑Pi2

Pi是樣本中第i個(gè)線蟲分類單元個(gè)體數(shù)占土壤線蟲分類單元總體數(shù)量的比例。土壤線蟲種類數(shù)目是描述土壤線蟲群落的重要指標(biāo)，文庫(kù)OTU 數(shù)目（S）代表土壤線蟲種類數(shù)目。

為了分析轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲群落的差異，采用SPSS 軟件對(duì)Shannon、Simpson 指數(shù)和S 進(jìn)行方差分析。

1.7 土壤線蟲群落指數(shù)分析

根據(jù)土壤線蟲物種信息劃分營(yíng)養(yǎng)類群：食細(xì)菌線蟲（bacterivores，Ba）、植食性線蟲（plant parasitic nematodes，PP）、食真菌線蟲（fungivores，F(xiàn)u）、雜食-捕食性線蟲（omnivores-predatores，Om），將分離得到的每個(gè)屬線蟲賦予c-p 值（colonize-persister），并計(jì)算各線蟲營(yíng)養(yǎng)類群相對(duì)豐度和群落指數(shù)（Shannon et al.，1950；Ferris et al.，2001）。

富集指數(shù)EI=100×〔e/（e+b）〕

式中，b包括Ba2 和Fu2 類群，e包括Ba1 和Fu2 類群。

結(jié)構(gòu)指數(shù)SI=100×〔s/（s+b）〕

式中，s包括 Ba3-Ba5（c-p 值為3～5 的食細(xì)菌線蟲比例）、Fu3-Fu5（c-p 值為3～5 的食真菌線蟲比例）、Om3-Om5（c-p 值為3～5 的雜食-捕食線蟲比例）類群。

線蟲通路指數(shù) NCR=NBa/（NBa+NFu）

式中NBa指食細(xì)菌性線蟲的數(shù)量，NFu指食真菌性線蟲的數(shù)量。

為了分析轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲群落的差異，采用SPSS 軟件對(duì)EI、SI 和NCR 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤線蟲類群分析

非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲文庫(kù)分別獲得73、75 和78 個(gè)有效克隆子。轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲文庫(kù)分別獲得74、75 和76 個(gè)有效克隆子。以97%閾值劃分OTU，非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲文庫(kù)分別獲得22、23、23 個(gè)OTU；轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤線蟲文庫(kù)獲得23、25、22 個(gè)OTU。

在線蟲屬分類水平上，轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤獲得13 個(gè)線蟲屬，分別為：小桿線蟲屬（Rhabditis）、頭葉線蟲屬（Cephalobus）、擬麗突線蟲屬（Acrobelodies）、根結(jié)線蟲屬（Meloidogyne）、原桿線蟲屬（Protorhabditis）、孢囊線蟲屬（Heteroder）、矮化線蟲屬（Tylenchorhycbus）、短體線蟲屬（Pratylenchus）、莖線蟲屬（Ditylenehus）、滑刃線蟲屬（Aphelenchoides）、胼眂擬毛刺線蟲屬（Paratrichodorus）、棱咽線蟲屬（Prismatolaimus）、遍宮線蟲屬（Ecumenicus）。非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤獲得除原桿線蟲屬、棱咽線蟲屬、胼眂擬毛刺線蟲屬以外的10 個(gè)線蟲屬。轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲優(yōu)勢(shì)屬都為：小桿線蟲屬、頭葉線蟲屬、擬麗突線蟲屬。小桿線蟲屬線蟲在轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤中所占比例較高且相近，分別為44.0%和36.0%。頭葉線蟲屬在轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤中占第2 位，分別為22.9%和23.3%。擬麗突線蟲屬在轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤中所占比例分別為8.6%和9.6%（圖1-A 和1-B）。

圖1 轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲各屬比例

2.2 土壤線蟲營(yíng)養(yǎng)類群分析

轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤中食細(xì)菌線蟲為優(yōu)勢(shì)營(yíng)養(yǎng)類群，所占比例分別為77.1%和73.2%，無(wú)顯著差別（圖2）。植食性線蟲居第二位，所占比例分別為20.0%和25.4%差異顯著（P=0.003），其中非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤中植食性線蟲比例高于轉(zhuǎn)基因黃瓜，主要源于非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤中根結(jié)線蟲數(shù)量較多，這也證實(shí)轉(zhuǎn)基因黃瓜對(duì)根結(jié)線蟲具有一定的抑制作用。食真菌線蟲和捕食性線蟲在轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤中均為稀有類群，所占比例較小。

圖2 轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲營(yíng)養(yǎng)類群

2.3 土壤線蟲多樣性指數(shù)分析

從多樣性指數(shù)來(lái)看（表1），轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲的Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)以及土壤線蟲的物種數(shù)目（S）均與非轉(zhuǎn)基因黃瓜無(wú)顯著差異?？傮w來(lái)看，轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤線蟲的多樣指數(shù)與非轉(zhuǎn)基因黃瓜無(wú)顯著差異。

表1 轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲多樣性指數(shù)

2.4 土壤線蟲群落指數(shù)分析

從土壤線蟲群落指數(shù)來(lái)看（表2），轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲的富集指數(shù)（EI）、結(jié)構(gòu)指數(shù)（SI）以及土壤線蟲的線蟲通路指數(shù)（NCR）與轉(zhuǎn)非基因黃瓜均無(wú)顯著差異。

表2 轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲生態(tài)指數(shù)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)mapk基因黃瓜根際土壤線蟲優(yōu)勢(shì)類群與非轉(zhuǎn)基因黃瓜基本一致，均為小桿線蟲屬、頭葉線蟲屬和擬麗突線蟲屬。研究表明，小桿線蟲屬線蟲對(duì)土壤環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，生活史短，世代交替快，繁殖迅速，因此種群數(shù)量多，在各類型土壤中均為優(yōu)勢(shì)類群，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致（曾四滿，2016；趙婉婷 等，2019）?？自频龋?018）研究發(fā)現(xiàn)玉米田土壤中頭葉線蟲屬線蟲為優(yōu)勢(shì)類群，也表明該屬線蟲具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，與本試驗(yàn)結(jié)果較為一致。擬麗突線蟲屬線蟲具有很寬的生態(tài)幅（12～35 ℃），對(duì)溫度要求較低，環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)（Anderson &Coleman，1982；Bakonyi &Nagy，2000；郭佳惠 等，2018）。本試驗(yàn)中擬麗突線蟲屬線蟲的比例相對(duì)較高，也表明該線蟲適應(yīng)大棚土壤溫度環(huán)境。轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲的線蟲通路指數(shù)均較高，表明溫室土壤有機(jī)質(zhì)分解過(guò)程以細(xì)菌通道為主，細(xì)菌豐度高，為食細(xì)菌線蟲提供豐富食物來(lái)源，這也是食細(xì)菌線蟲成為優(yōu)勢(shì)類群的主要原因。

從土壤線蟲多樣性指數(shù)和生態(tài)指數(shù)來(lái)看，轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲群落的Shannon、Simpson、EI、SI 和NCR 指數(shù)無(wú)顯著差異，表明轉(zhuǎn)mapk基因黃瓜并未對(duì)根際土壤線蟲產(chǎn)生顯著的影響，其原因可能有兩方面：一方面，土壤線蟲包括食細(xì)菌線蟲、食真菌線蟲和雜食-捕食性線蟲，主要取食土壤細(xì)菌、真菌或其他線蟲，不取食植物。因此，轉(zhuǎn)基因黃瓜表達(dá)的mapk雙鏈RNA 不會(huì)對(duì)這幾類線蟲產(chǎn)生直接作用（閆小梅，2015）。另一方面，轉(zhuǎn)基因黃瓜表達(dá)的mapk雙鏈RNA 隨根系分泌物進(jìn)入土壤，可能被土壤中的RNA 酶所降解，失去生物活性（王艷艷 等，2015），不能發(fā)揮對(duì)土壤線蟲的抑制作用。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土壤線蟲中也有一定數(shù)量的根結(jié)線蟲，并且根結(jié)線蟲在轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤線蟲中所占比例較低，表明轉(zhuǎn)基因黃瓜對(duì)根結(jié)線蟲有一定的抑制作用。本試驗(yàn)中選用的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株能夠表達(dá)的mapk雙鏈 RNA，對(duì)侵入黃瓜根內(nèi)的根結(jié)線蟲進(jìn)行RNA 干擾，從而殺死根結(jié)線蟲（陳國(guó)華，2008）。

總體來(lái)看，轉(zhuǎn)mapk雙鏈RNA 表達(dá)載體黃瓜并未對(duì)土壤線蟲多樣性有顯著影響，但后續(xù)需繼續(xù)觀察長(zhǎng)期的累積效應(yīng)，其對(duì)根際土壤真核生物群落的影響還需深入研討。