萵苣花青素研究進展

邱正明 嚴承歡* 黃 燕 劉志雄 朱鳳娟 吳金平 郭鳳領

（1 湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，湖北武漢 430064；2 華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院，湖北武漢 430070；3 蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064）

萵苣（Lactuca sativa，2n=18）屬于菊科萵苣屬，在世界范圍內(nèi)廣泛種植（Coria-Cayupan &Pinto，2009）。全球的萵苣栽培面積已達122 萬hm2，總產(chǎn)量約2 678 萬t，其中超過50%的栽培面積和產(chǎn)量均來自中國（http：//www.fao.org/faostat/en/）。萵苣經(jīng)濟價值較高，僅2015 年美國的葉用萵苣（生菜）產(chǎn)值已達30 億美元，且該數(shù)值逐年增加（Wells et al.，2016）。根據(jù)表型差異，可以將萵苣分為6 種栽培類型：結球生菜、奶油生菜、散葉生菜、羅馬生菜、萵筍以及油用萵苣（Zhang et al.，2017）；根據(jù)是否含有花青素，可以將萵苣分為紫色萵苣和綠色萵苣。除結球生菜以外，其他5 種萵苣栽培類型均含有紫色品種。紫色萵苣因其顏色艷麗，富含花青素，具有一定的抗氧化、降低血壓、預防癌癥等功效，逐漸受到人們的青睞，如紫冠、紫羅馬、紫翠等紫色萵苣品種。萵苣中花青素主要類型為矢車菊素，不同萵苣品種花青素含量差異顯著（Kim et al.，2016）。本文擬通過闡述近年來萵苣花青素生物合成與調(diào)控領域的重要研究進展，闡明萵苣花青素的生物合成與調(diào)控途徑，以及影響萵苣花青素形成的主要環(huán)境因素，為開發(fā)富含花青素的萵苣功能性食品提供參考依據(jù)。

1 植物花青素的化學結構及種類

花青素（anthocyanins）是植物中最大的一類水溶性類黃酮化合物，廣泛分布于植物界中（Tohge et al.，2013）?；ㄇ嗨氐幕竟羌転镃6-C3-C6 結構，根據(jù)B 環(huán)上取代基的不同而產(chǎn)生不同類型的花青素（呂玲玲 等，2018）。自然界中常見的花青素類型主要有6 種（Zhang et al.，2014），包括矢車菊素（cyanidin）、飛燕草素（delphinidin）、天竺葵素（pelargonidin）、矮牽牛素（petunidin）、芍藥素（peonidin）以及錦葵花素（malvidin）（圖1）。以上花青素類型中的羥基可以與不同的糖類結合進而產(chǎn)生不同類型的花色苷，萵苣中的花色苷主要是矢車菊素糖苷化后與有機酸結合的產(chǎn)物（Mulabagal et al.，2010）。自然界中已發(fā)現(xiàn)的花色苷種類超過600 種，不同類型的花色苷產(chǎn)生的顏色略有差異，矢車菊素及其衍生物主要呈紫色，天竺葵素及其衍生物呈紅色，飛燕草素及其衍生物呈藍色或者紫色（Grotewold，2006）。此外，植物液泡的pH 值也會影響花青素的顏色，當pH 值為1.0～2.0 時，花青素呈紅色；當pH 值為6.0～6.5 時，花青素呈藍色；當pH＞7.0 時，花青素呈淺黃色（Zhang et al.，2014）。在萵苣中，花青素主要呈紫色，因其含量以及葉片背景顏色的差異而形成不同的紫色萵苣品種。不同紫色萵苣品種的葉片花青素含量差異較大，在3.665～1 496.934 nmol·g-1（FW）之間均有分布，一般情況下花青素含量與其組織顏色深淺呈正相關（郝敬虹 等，2014）。

圖1 自然界中常見的6 種花青素結構

2 萵苣花青素的生物合成

花青素生物合成途徑屬于類黃酮合成途徑的一個分支，該生物合成途徑非常保守，是植物中研究最深入的次生代謝途徑之一（Tanaka &Ohmiya，2008）。萵苣花青素的生物合成途徑與模式植物擬南芥類似（蘇文清，2018），主要分為3 個階段（圖2）。第一階段為類黃酮合成的共用途徑，以苯丙氨酸（phenylalanine）為底物，分別在苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酰CoA 連接酶（4CL）的作用下產(chǎn)生4-香豆酰CoA（4-coumaroyl CoA）。第二階段為類黃酮生物合成的關鍵階段，所涉及基因為早期生物合成途徑基因（early biosynthetic genes，EBGs）。在查耳酮合成酶（CHS）作用下，1 份4-香豆酰CoA 和3 份丙二酰CoA（malonyl-CoA）產(chǎn)生柚配基查爾酮（naringenin chalcone），在查耳酮異構酶（CHI）作用下轉(zhuǎn)化為柚皮素（naringenin），進一步在黃烷酮3-羥化酶（F3H）的催化下產(chǎn)生二氫山柰酚（dihydrokaempferol），而類黃酮3′-羥化酶（F3′H）和類黃酮3′，5′-羥化酶（F3′5′H）又分別催化二氫山柰酚產(chǎn)生二氫槲皮素（dihydroquercetin）和二氫楊梅素（dihydromyricetin）。第三階段為花青素合成與修飾階段，所涉及基因為晚期生物合成途徑基因（late biosynthetic genes，LBGs）。在二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）作用下，二氫黃酮醇產(chǎn)生對應的無色花青素，之后在無色花青素雙加氧酶/花青素合成酶（LDOX/ANS）作用下分別轉(zhuǎn)化為矢車菊素、天竺葵素和飛燕草素等3 種顯色花青素。這些花青素的化學性質(zhì)并不穩(wěn)定，需要通過類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）、甲基轉(zhuǎn)移酶、酰基轉(zhuǎn)移酶等修飾后形成化學性質(zhì)穩(wěn)定的花色苷產(chǎn)物。此外，在谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）等基因的幫助下，修飾過的花色苷被運輸?shù)揭号荽鎯Γ–heng et al.，2015），在pH值、金屬離子等因素的共同作用下植物顯現(xiàn)出各種顏色。

圖2 萵苣花青素生物合成及調(diào)控途徑

紫色萵苣材料中，多個EBGs 和LBGs 上調(diào)表達，包括CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR和ANS等基因（Zhang et al.，2016）。除上述基因外，在紫色散葉生菜材料中花青素?；D(zhuǎn)移酶AT基因顯著上調(diào)表達（岳貞，2014）?；ㄇ嗨乇磉_調(diào)控網(wǎng)絡研究結果顯示，兩個花青素合成途徑基因GST和ANS與萵苣花青素積累緊密相關（Zhang et al.，2017），其中LsANS負責無色花青素轉(zhuǎn)化為顯色花青素，LsGST控制花色苷向液泡的轉(zhuǎn)運過程。在草莓中鑒定到1 個FaGST基因功能缺失的突變體，其葉柄和果實均不能變?yōu)榧t色（Luo et al.，2018）。類似的，在萵苣中LsANS和LsGST的功能缺失則不能形成紫色萵苣（Su et al.，2019）?；ㄇ嗨亟M分分析顯示，萵苣Cherokee 中花青素主要為矢車菊素-3-O-6′-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷，并且其可以快速轉(zhuǎn)化為矢車菊素-3-O-6′-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷甲酯和矢車菊素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷（Mulabagal et al.，2010），該結果與Su 等（2019）的研究結果一致。以上研究結果表明，在萵苣中F3′5′H 花青素合成分支受到抑制，而F3′H 活性較強，因此萵苣花青素生物合成以矢車菊素分支為主要合成途徑。

3 萵苣花青素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

花青素的生物合成主要受MBW 三元復合體調(diào) 控，包 括MYB、bHLH 以 及WD40 等3 類 轉(zhuǎn)錄因子（Ramsay &Glover，2005），其中MYB 和bHLH 轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結合激活目的基因表達，而WD40 主要作為載體穩(wěn)定復合體結構（圖2）。根據(jù)MYB 轉(zhuǎn)錄因子上R 基序的不同可以將其分為多種類型，其中參與花青素激活的MYB 轉(zhuǎn)錄因子主要為R2R3-MYB，如PAP1、PAP2 和MYB12 等（Stracke et al.，2001），而抑制花青素生物合成的MYB 轉(zhuǎn)錄因子為R3-MYB 和部分R2R3-MYB，如CPC（Zhu et al.，2009）、MYB27（Albert et al.，2014）等。在擬南芥中，GL3 和EGL3 兩個bHLH轉(zhuǎn)錄因子均涉及花青素的調(diào)控，且存在功能冗余（Zhang et al.，2003）。此外，WD40 作為MBW 三元復合體的載體，也是花青素合成的重要調(diào)控因子，如TTG1（Walker et al.，1999）等。

轉(zhuǎn)錄組分析顯示，在萵苣中MBW 三元復合體轉(zhuǎn)錄因子促進花青素積累，如MYB12、MYB75、MYB90、EGL1、TTG1 等（Zhang et al.，2016）。與通常的R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子激活花青素生物合成不同，1 個R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子AtMYB60 可以抑制萵苣花青素的積累（Park et al.，2008）。Zhang等（2017）利用RNA-seq 測序技術，對全世界范圍內(nèi)的240 份萵苣栽培種及野生材料進行測序，采用GWAS（genome-wide association study）分析發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控萵苣花青素的積累，包括MYB113（LG5_426271）、bHLH42（LG5_467062）等。Su 等（2019）研究表明，萵苣花青素生物合成受多個轉(zhuǎn)錄因子（≥4 個）控制（圖3），包括RLL1（bHLH）、RLL2（R2R3-MYB）、RLL3（R3-MYB）和RLL4（WD40）。這些轉(zhuǎn)錄因子中，bHLH 和R2R3-MYB 為正調(diào)控因子，而R3-MYB和WD40 為負調(diào)控因子。當R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子處于激活狀態(tài)，則促進花青素積累，產(chǎn)生紫葉萵苣；而bHLH 功能缺失時，導致花青素生物合成途徑被阻斷，產(chǎn)生綠葉萵苣。此外，當R3-MYB 和WD40 發(fā)生變異時，其對花青素生物合成途徑的抑制作用解除，進而產(chǎn)生淺紫/紫葉萵苣（圖3）。值得注意的是，該研究中RLL4（WD40）雖然為AtRUP1/AtRUP2 的同源體，但其并不通過MBW三元復合體途徑對花青素的積累產(chǎn)生影響，因此在萵苣中RLL4 可能存在一個與擬南芥不同的調(diào)控花青素生物合成的機制。

4 萵苣花青素合成的影響因素

除遺傳因素外，多種環(huán)境因子均影響花青素的生物合成，如光照、溫度、土壤pH、肥力等（Winkel-Shirley，2001；Gould，2004）。對萵苣而言，光照和溫度是影響其花青素生物合成最重要的環(huán)境因子。

4.1 光照

光照是影響萵苣花青素生物合成最重要的環(huán)境因子，有無光照直接影響花青素的合成與否。Zhang 等（2018）研究表明，光密度增加可以顯著增加萵苣花青素的積累。除光強對花青素的有無起決定作用外，光質(zhì)也是萵苣花青素生物合成的重要影響因素。萵苣花青素積累依賴UV-B（280～315 nm）途徑，通過照射UV-B 可使花青素生物合成基因CHS、F3H、DFR等上調(diào)表達，進而產(chǎn)生紫色萵苣（Park et al.，2007）。此外，藍光（440 nm）也可以極大地促進花青素的生物合成，進而形成紫色萵苣（Stutte et al.，2009）。研究表明，光照對花青素生物合成的影響主要存在兩種方式：一是通過泛素化降解途徑，COP1 蛋白與MYB基因互作，調(diào)控MYB基因?qū)庹盏母兄欢侵苯幼饔糜谵D(zhuǎn)錄因子，如HY5、MYB等基因啟動子上的光響應元件，進而調(diào)控花青素的生物合成（黃鼎，2018）。

圖3 萵苣花青素調(diào)控示意圖及其對應表型

4.2 溫度

一般認為，溫度是影響萵苣花青素生物合成的另一個重要環(huán)境因子。一定范圍內(nèi)的低溫可以促進萵苣花青素的生物合成，溫度過低或者過高均不利于花青素的積累，并且夜間低溫可以減緩高溫對萵苣花青素積累的影響（Gazula et al.，2005）。在較低溫度〔20 ℃/13 ℃（晝/夜），下同〕條件下，萵苣花青素積累量較高，但隨著溫度升高（30 ℃/25℃）花青素含量顯著降低（Boo et al.，2011）。低溫是如何誘導萵苣花青素積累的分子機制還有待進一步研究。

4.3 其他

除光照和溫度外，水分、CO2濃度等因素均影響萵苣花青素的生物合成。水分缺乏有利于促進萵苣花青素的積累，增強萵苣的抗氧化能力（Baslam &Goicoechea，2012）。高濃度的CO2（1 000 μmol·mol-1）可顯著增加萵苣花青素的生物合成，促進花青素的積累（Park et al.，2013）。此外，有報道顯示外源噴施一定濃度的硒（0～8 μmol·L-1），可顯著增加萵苣花青素的積累（Liu et al.，2017），其作用機制還需進一步研究。

5 展望

隨著2017 年萵苣全基因組數(shù)據(jù)的公布，表明萵苣的研究已進入功能基因組學時代（Reyes-Chin-Wo et al.，2017）。高質(zhì)量的基因組圖譜為深入解析萵苣花青素積累的分子機制奠定了堅實的基礎。目前，雖然萵苣花青素的遺傳學及功能研究取得了長足進步，但還有多個問題值得深入研究：①鑒定新的調(diào)控萵苣花青素積累的轉(zhuǎn)錄因子；②萵苣花青素依賴UV-B 途徑積累的分子機制；③光質(zhì)影響萵苣花青素積累的分子機制；④萵苣花青素的修飾、轉(zhuǎn)運和降解機制等。萵苣花青素積累的遺傳與分子機制的解析，有助于深入了解萵苣中花青素的代謝過程，有利于未來通過聚合育種、人工定向誘變和基因編輯等技術培育富含花青素的紫色萵苣新材料。將紫色萵苣開發(fā)為富含花青素的功能性食品，結合植物工廠生產(chǎn)模式（賀冬仙，2018），可為萵苣未來的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新路徑。