手術(shù)結(jié)合化學(xué)單側(cè)迷路切除術(shù)建立急性前庭損傷小鼠模型

王穎怡 解龍昌 陳文勇 陳偉杰 陳盛強(qiáng) 袁忠民 崔勇

1 廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）耳鼻咽喉科（廣州510080）2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州510260）3 廣東省中醫(yī)院耳鼻喉科（廣州510120）4 廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510000）5廣州醫(yī)科大學(xué)（廣州510000）

單側(cè)迷路切除術(shù)（Unilateral Labyrinthectomy,UL），同時(shí)配合化學(xué)迷路切除，作為一種可靠的外周前庭損傷模型的方法，已經(jīng)在急性前庭損傷動(dòng)物模型的建立中被廣泛應(yīng)用。

關(guān)于急性前庭損傷動(dòng)物的建模方法，目前分為單純手術(shù)模型及手術(shù)配合化學(xué)模型這兩種。其中手術(shù)模型包括從頸部腹側(cè)入路、耳前入路，從而機(jī)械性破壞膜迷路的單側(cè)迷路切除術(shù)。頸側(cè)入路利于暴露術(shù)野，但容易傷及頸部大血管，從而引起動(dòng)物出血致死。而耳前入路避開(kāi)了頸部大血管，較為安全，但該入路較難暴露術(shù)野，具有一定操作難度。跟化學(xué)配合手術(shù)方法相比，單純的手術(shù)方法僅僅在視覺(jué)上破壞了前庭終器，特別是在器械無(wú)法到達(dá)的位置，仍可能存在殘留的神經(jīng)上皮。因此，手術(shù)配合化學(xué)的建模方式能夠在手術(shù)破壞后，通過(guò)化學(xué)溶劑來(lái)保證殘存的神經(jīng)上皮的破壞。

目前，急性前庭損傷的動(dòng)物模型以大鼠模型為主，國(guó)內(nèi)暫無(wú)急性前庭損傷小鼠模型的報(bào)道，而國(guó)際上也鮮有該方面的報(bào)道。分析原因可能是小鼠的單側(cè)前庭切除在操作上較為困難。但是，小鼠模型的建立有其必要性：跟大鼠相比，小鼠的總體研究成本較低，故利于研究的開(kāi)展；其次，小鼠的行為學(xué)測(cè)試易于操作，故利于建模后繼續(xù)進(jìn)行前庭代償?shù)挠?xùn)練和相關(guān)研究；最后，利于日后使用定制的基因敲除小鼠以進(jìn)一步研究其疾病機(jī)制及基因功能。因此，在本研究中我們探討使用手術(shù)配合化學(xué)切除的方法來(lái)建立急性前庭損傷小鼠模型，并對(duì)該模型進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康成年雄性C57BL/6J 小鼠（20～30g）共21 只，均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將小鼠隨機(jī)分為單側(cè)迷路切除術(shù)組(n=15)及假手術(shù)組(n=6)兩組。

1.2 手術(shù)準(zhǔn)備

所有小鼠均在術(shù)前禁飲禁食6小時(shí)。在6小時(shí)的禁飲禁食后，使用異氟烷氣體麻醉小鼠，再給小鼠的眼睛涂上紅霉素軟膏并貼上貼膜以保護(hù)眼睛。剃除小鼠耳周毛發(fā)，在術(shù)口局部注射0.02 ml的利多卡因注射液以局部浸潤(rùn)麻醉，腹腔內(nèi)注射0.7 ml的生理鹽水以防止小鼠出現(xiàn)脫水。

1.3 手術(shù)過(guò)程

在顯微鏡下，對(duì)單側(cè)迷路切除術(shù)組的小鼠進(jìn)行小鼠左耳的單側(cè)迷路切除術(shù)。手術(shù)選擇耳前切口，切開(kāi)后使用鑷子進(jìn)行鈍性分離，操作時(shí)注意保護(hù)面神經(jīng)及血管。滲血時(shí)，使用明膠海綿按壓止血。使用精細(xì)的鉤針鉤除鼓膜，再鉤除錘骨、砧骨，此時(shí)可見(jiàn)鐙骨及穿過(guò)鐙骨前后弓之間的鐙骨動(dòng)脈。以手持單極電凝器對(duì)此動(dòng)脈的兩端進(jìn)行電凝。用精細(xì)的鉤針勾除鐙骨，打開(kāi)鐙骨底板，暴露前庭池，將直角鉤針擴(kuò)大卵圓窗邊緣骨質(zhì)以擴(kuò)大暴露前庭池，輕輕地勾除骨壁。用吸引器吸除內(nèi)淋巴液，尋找橢圓囊及球囊斑并以精細(xì)鉤針去除。尋找半規(guī)管的位置，通過(guò)勾針進(jìn)行機(jī)械性的破壞。并使用吸引器的吸力對(duì)半規(guī)管進(jìn)行破壞。在上述的機(jī)械性破壞后，往前庭內(nèi)塞入含有無(wú)水乙醇的明膠海綿，并進(jìn)行皮膚的縫合。而對(duì)于假手術(shù)組的小鼠，選擇耳前切口，打開(kāi)其外耳道，再進(jìn)行皮膚的縫合。

在術(shù)中給所有小鼠腹腔注射0.5ml的生理鹽水以補(bǔ)液，術(shù)后復(fù)蘇過(guò)程中注意保溫。

2 急性前庭損傷動(dòng)物模型的評(píng)估

2.1 行為學(xué)觀察

單側(cè)迷路切除術(shù)后的小鼠在清醒后均開(kāi)始出現(xiàn)一種特殊的偏斜姿勢(shì)(圖1)，頭右偏，行走時(shí)向右轉(zhuǎn)圈，身體呈筒狀翻滾，提尾時(shí)出現(xiàn)以身體為軸線的旋轉(zhuǎn)（圖2）。術(shù)后第二天，癥狀基本同前。在術(shù)后第三天，行走時(shí)向右轉(zhuǎn)圈，身體筒狀翻滾的體征出現(xiàn)明顯的改善。并隨著時(shí)間推移，以上體征逐漸緩解。在一周后，可觀察到小鼠的前庭癥狀完成初步代償。但提尾時(shí)以身體為軸線的旋轉(zhuǎn)在術(shù)后2個(gè)月時(shí)依然存在。而假手術(shù)組小鼠在清醒后并無(wú)前庭損傷的癥狀出現(xiàn)。

圖1 單側(cè)迷路切除術(shù)后的小鼠出現(xiàn)的偏斜姿勢(shì)：頭右偏，行走時(shí)向右轉(zhuǎn)圈Fig. 1 The mouse underwent UL showed a deviated posture,including head tilt and the tendency of body circle towards the operated ear

圖2 單側(cè)迷路切除術(shù)后的小鼠開(kāi)始出現(xiàn)提尾后的以身體為軸線的快速旋轉(zhuǎn)Fig. 2 The mouse underwent UL showed rapid body spin on its body's axis

2.2 行為學(xué)檢測(cè)

兩組小鼠均在術(shù)后第10天接受爬桿試驗(yàn)及平衡木試驗(yàn)。在爬桿試驗(yàn)（Pole test）中，小鼠頭朝下地被放置于木桿的頂部，測(cè)量其從頂部至底部所需時(shí)間。在平衡木試驗(yàn)（Beam-crossing test），小鼠被放在平衡木的起點(diǎn)，允許其探索儀器1 分鐘，然后開(kāi)始記錄其通過(guò)平衡木的時(shí)間，根據(jù)其通過(guò)平衡木的時(shí)間以評(píng)分：0-5 秒，1 分；6-10 秒，2 分；11-15秒，3分；16-20秒，4分；21-25秒，5分；＞25秒，6分；掉落10 分。使用SPSS25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：在爬桿試驗(yàn)中，手術(shù)組(n=15)、假手術(shù)組(n=6)平均值分別為10.60±2.29、5.83±0.98；平衡木試驗(yàn)中，得分平均值分別為3.80±2.08、1.83±0.41；兩組之間爬桿試驗(yàn)（P=0.000）及平衡木試驗(yàn)（P=0.002）檢測(cè)結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。由此可見(jiàn)術(shù)后第10天的手術(shù)組小鼠雖然在觀察下可見(jiàn)前庭癥狀初步完成代償，但是其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能跟假手術(shù)組小鼠比較仍較差。該結(jié)果提示在術(shù)后第10 天，前庭損傷小鼠模型尚未完全完成前庭代償。

表1 兩組小鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果Table 1 The results of behavioral tests between UL group and sham operated group

3 討論

前庭系統(tǒng)具有形成姿勢(shì)、控制動(dòng)眼神經(jīng)的作用，并與感覺(jué)神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)密切聯(lián)系，還有促進(jìn)高級(jí)認(rèn)知過(guò)程的作用，包括空間感知、空間導(dǎo)航、身體呈現(xiàn)、注意力、記憶力、心理意象、甚至社會(huì)認(rèn)知等[1]。平衡功能的維持，需要前庭覺(jué)、本體覺(jué)、視覺(jué)三者相互協(xié)調(diào)和它們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的整合，而前庭系統(tǒng)是最為重要的；前庭系統(tǒng)可在不同的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頭部位置時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的位置覺(jué)、運(yùn)動(dòng)覺(jué)，還能調(diào)控肌肉和軀體運(yùn)動(dòng)，使人體保持相應(yīng)姿勢(shì)，維持平衡功能[2]。 目前在國(guó)際上，將前庭癥狀分為四類：眩暈、頭暈、前庭-視覺(jué)癥狀及姿勢(shì)性癥狀[3]。當(dāng)人或者動(dòng)物的一側(cè)前庭外周器官受損時(shí)，因其突然喪失前庭功能，會(huì)出現(xiàn)眩暈、惡心、嘔吐，快相偏向健側(cè)的自發(fā)性眼震，并且頭向患側(cè)偏斜，站立不穩(wěn)，向患側(cè)方向傾斜等癥狀；動(dòng)物還可出現(xiàn)沿身體縱軸向患側(cè)方向翻滾，被動(dòng)或固定環(huán)形步態(tài)等[4]。在急性期，受損側(cè)前庭神經(jīng)核的神經(jīng)元的靜息電位減少，而對(duì)側(cè)前庭神經(jīng)核的神經(jīng)元?jiǎng)t變得過(guò)度活躍，因此受損側(cè)和健側(cè)的前庭神經(jīng)核之間的靜息電位嚴(yán)重不對(duì)稱，出現(xiàn)了上述的偏斜姿勢(shì)、眼震等癥狀[5]。在一些物種中，一些靜態(tài)癥狀會(huì)在沒(méi)有外周前庭系統(tǒng)再生的情況下，在一周內(nèi)出現(xiàn)改善，這種過(guò)程被稱為前庭代償[6]，該概念由Bechterew 在1883年首先提出。當(dāng)外周性前庭功能減退或喪失時(shí)，在雙側(cè)前庭傳入沖動(dòng)不對(duì)稱的情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠逐漸適應(yīng)，這是一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)元和神經(jīng)化學(xué)反應(yīng)過(guò)程[7]。研究顯示在一周內(nèi)雙側(cè)前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元同時(shí)出現(xiàn)了靜息活動(dòng)的再平衡[8]。前庭功能受損后的癥狀包括靜態(tài)癥狀和動(dòng)態(tài)癥狀，即在靜止?fàn)顟B(tài)或活動(dòng)狀態(tài)時(shí)出現(xiàn)的癥狀,前者包括頭部及身體傾斜、反向偏斜、自發(fā)性眼震、眩暈等；后者包括前庭-眼反射的增益下降及相位不齊、受損側(cè)前庭-眼反射的時(shí)間常數(shù)縮小、在挑戰(zhàn)性環(huán)境下的平衡能力下降等[9]。而靜態(tài)和動(dòng)態(tài)反射的前庭代償時(shí)間進(jìn)程是不同的：靜態(tài)癥狀一般在一周內(nèi)恢復(fù)，而動(dòng)態(tài)癥狀趨于在幾個(gè)月后才恢復(fù)正常[10]。

單側(cè)急性前庭損傷后的前庭代償，是一個(gè)復(fù)雜、多因素的過(guò)程，涉及大腦多個(gè)區(qū)域的突觸和神經(jīng)元可塑性?？伤苄詻Q定了行為恢復(fù)的速率和程度，找出可塑性的關(guān)鍵部位是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。它包括了具有加工前庭信號(hào)作用的成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛區(qū)域，如前庭神經(jīng)核，小腦，下橄欖核[11]?，F(xiàn)今，急性前庭損傷動(dòng)物模型被用作損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性研究的一個(gè)適合的模型。只有建立穩(wěn)定、有效的相關(guān)動(dòng)物模型，才能進(jìn)一步研究前庭損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性機(jī)制，并能研究促進(jìn)其可塑性的方法。

本小鼠模型使用手術(shù)配合化學(xué)單側(cè)迷路切除術(shù)以建立，能夠真實(shí)地模擬前庭損傷的病理情況，因此可以作為研究前庭損傷后自發(fā)出現(xiàn)的前庭代償機(jī)制以及損傷后康復(fù)的治療方法的有效工具。目前，前庭代償?shù)膭?dòng)物模型多為大鼠，國(guó)際上亦極少有前庭代償小鼠模型的研究。探究其原因可能是小鼠的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)精小，操作上存在一定困難。但小鼠模型具有明顯優(yōu)勢(shì)，其基因數(shù)量、染色體結(jié)構(gòu)均與人類相似，所以其生理、生化指標(biāo)及其調(diào)控機(jī)制和人類相同或相似，故可以從小鼠中獲得較為可靠的數(shù)據(jù)；小鼠繁殖能力強(qiáng)，生殖周期短，能極大地節(jié)省研究成本及研究時(shí)間；其體積小，方便在有限空間內(nèi)大量飼養(yǎng)，利于進(jìn)行關(guān)于前庭代償?shù)拇笠?guī)模實(shí)驗(yàn)；在對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)易于抓取，尤其是在進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試、康復(fù)訓(xùn)練中，較容易操作，因此可通過(guò)小鼠模型獲得有關(guān)潛在治療藥物及康復(fù)訓(xùn)練的療效評(píng)估；跟大鼠相比，基因修飾小鼠模型價(jià)格較為低廉。若建立該小鼠模型，日后還能結(jié)合基因敲除小鼠進(jìn)行疾病機(jī)制、基因作用的相關(guān)研究。

本文所述的建模方法使用耳前切口行單側(cè)迷路切除術(shù)，在機(jī)械破壞后，往前庭內(nèi)塞入含有無(wú)水乙醇的明膠海綿。本方法穩(wěn)定、有效，造模成功率高，具有以下優(yōu)勢(shì)：在術(shù)前對(duì)小鼠進(jìn)行禁飲禁食，避免了麻醉后出現(xiàn)誤吸的可能；使用了氣體麻醉配合局部麻醉的方法，減少全身麻醉藥物的用量，減少小鼠在麻醉后出現(xiàn)的不良反應(yīng)；在顯微鏡下進(jìn)行精細(xì)的操作，可以精細(xì)地去除前庭組織，該方法在直視下進(jìn)行，較為準(zhǔn)確可靠；使用了手術(shù)配合化學(xué)的方法，能夠充分破壞前庭神經(jīng)上皮；術(shù)中使用了精細(xì)的單極電凝處理鐙骨動(dòng)脈，避免術(shù)中出血致死及血污影響術(shù)野的情況發(fā)生。筆者認(rèn)為，在進(jìn)行急性前庭損傷動(dòng)物模型的建立時(shí)，應(yīng)該注意以下方面：1.精細(xì)操作，避免損傷血管、神經(jīng)，滲血時(shí)使用明膠海綿壓迫止血，使用電凝筆處理鐙骨動(dòng)脈，避免小鼠因出血而致死；2.操作時(shí)充分暴露術(shù)腔，熟悉解剖結(jié)構(gòu)，仔細(xì)操作，以保證對(duì)前庭損傷完成精確的定量，以建立可量化損傷程度的動(dòng)物模型；3.小鼠術(shù)前曾禁飲禁食，且術(shù)中可能會(huì)有少量出血，而術(shù)后清醒的小鼠出現(xiàn)前庭功能喪失的劇烈癥狀，短時(shí)間內(nèi)難以進(jìn)食進(jìn)飲，故術(shù)前、術(shù)后應(yīng)進(jìn)行適量的補(bǔ)液，以避免小鼠出現(xiàn)脫水。

在小鼠復(fù)蘇后，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行為學(xué)觀察及行為學(xué)測(cè)試以判斷其前庭癥狀的程度。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，所有的單側(cè)迷路切除術(shù)的小鼠均出現(xiàn)一種特殊的偏斜姿勢(shì)，即頭右偏，行走時(shí)向右轉(zhuǎn)圈，身體呈筒狀翻滾，提尾時(shí)出現(xiàn)以身體為軸線的旋轉(zhuǎn)。隨著時(shí)間推移，以上體征逐漸緩解。在術(shù)后一周時(shí)，可觀察到小鼠的行走時(shí)轉(zhuǎn)圈，筒狀翻滾的靜態(tài)癥狀明顯緩解。通過(guò)對(duì)前庭脊髓系統(tǒng)的平衡功能進(jìn)行觀察，例如偏斜姿勢(shì)、失衡行為等癥狀的動(dòng)態(tài)觀察，可對(duì)前庭代償?shù)膭?dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行一定評(píng)估[12]。在術(shù)后10 天時(shí)，對(duì)單側(cè)迷路切除術(shù)小鼠進(jìn)行評(píng)估其平衡、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能的行為學(xué)檢測(cè)，結(jié)果提示與假手術(shù)組相比，單側(cè)迷路切除術(shù)小鼠的小鼠存在較差的表現(xiàn)，這可能是與動(dòng)態(tài)癥狀尚未恢復(fù)正常有關(guān)。而提尾時(shí)出現(xiàn)以身體為軸線旋轉(zhuǎn)的體征，在其術(shù)后2個(gè)月仍然存在。

如今，急性前庭損傷后的前庭代償?shù)臋C(jī)制及促進(jìn)其代償?shù)闹委煼椒ㄈ允且粋€(gè)有待解決的問(wèn)題。本文所述的急性前庭損傷動(dòng)物模型穩(wěn)定、有效、成功率高，能以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步探究以上問(wèn)題。