sRAGE通過AGEs-RAGE信號軸抑制小鼠SGCs的凋亡

吳小波 林昶

福建醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)學院

福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（福州350005）

老年性耳聾是影響世界上75歲以上老人生活質(zhì)量的重要致殘因素，它通常帶來對背景聲音的過濾障礙和聲音分辨的困難[1]。老年性耳聾是指來自于聽覺中樞、聽神經(jīng)及耳蝸的進行性不可逆性的損傷，而目前其損傷機制尚不明了[2]。因為老年聾發(fā)生的不可逆，目前主要干預措施在于如何保持聽力功能及有效提高日常溝通交流的能力。助聽器、電子耳蝸等是主要干預手段[3]。

晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products,RAGE）是晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products, AGEs）的一種受體。在小鼠SGCs、耳蝸毛細胞及血管紋內(nèi)均被被證實了RAGE 受體的表達[4-6]。RAGE 是多配體受體，其中配體之一AGEs是一大類非酶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)糖基化反應后終產(chǎn)物的總稱[7]，因其不易被酶水解，因而會隨著年齡的增加在體內(nèi)堆積；AGEs-RAGE信號軸的活化也早已被證實了包括老化在內(nèi)的多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用，其活化后可以通過氧自由基的產(chǎn)生、NF-κB的激活以及炎癥因子表達增加等而引起細胞凋亡和組織損傷[8]，因而我們認為AGEs-RAGE 信號軸有可能參與了老年性耳聾的病理過程，而AGEs-RAGE信號軸活化的有效抑制有可能為老年性耳聾提供新的治療方向?？扇苄酝砥谔腔K產(chǎn)物受體（soluble forms of RAGE，sRAGE）是RAGE mRNA 的選擇性剪切體，已經(jīng)證實，RAGE-配體信號軸引起的病理過程可以被sRAGE中和和抑制。本研究旨在探討sRAGE對暴露與未暴露于AGEs 的C57BL/6J 小鼠SGCs 凋亡的影響及細胞膜上RAGE表達情況，并探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液、F12/DMEM（1:1）液體培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購自美國HyClone 公司。阿糖胞苷、L-谷氨酰胺、GADPH抗體、FITC 標記山羊抗小鼠IgG、AnnexinV-FITC/PI、DEPC 水購自上海碧云天公司。神經(jīng)微絲蛋白抗體NP200、AGEs、BCL-2、Bax、caspase-3抗體購自英國abcam，sRAGE 購自中國Aviscera Bioscience 公司，RNA 提取試劑盒購自北京QIAGEN；RAGE、GAPDH 引物由上海生工生物有限公司合成。離心機Neofuge 15R 購自上海Heal Force 公司的產(chǎn)品，倒置顯微鏡AxioCam ERc5s 為德國Carl Zeiss 公司的產(chǎn)品，CO2恒溫培養(yǎng)箱HERA Cell 150i 為美國Thermo 公司的產(chǎn)品，解剖顯微鏡SZ51 為日本OlymPus 公司的產(chǎn)品，實時定量PCR 擴增儀StePOne 購自美國APPlied Biosystems 公司，流式細胞儀FACSCalibur 購自美國Becton Dickinson 公司，全自動凝膠成像儀JS-680D 購自上海培清公司，穩(wěn)壓電泳儀PowerPac Basic為美國Bioward公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

取新生3-5天的C57BL/6J小鼠雙側蝸軸后，采用機械分離蝸軸后0.25%胰蛋白酶消化分離出SGCs，將細胞重懸F12/ DMEM 完全培養(yǎng)基中，將5×104細胞加入多聚賴氨酸包被后的24孔板（內(nèi)含蓋玻片），在37℃，5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h后，更換為阿糖胞苷終濃度為7.5 μmol/L 的含谷氨酰胺的F12/ DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后更換為F12/DMEM培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。

1.3 SGCs免疫熒光鑒定

取生長狀態(tài)良好的SGCs（第5 天），4%多聚甲醛固定，PBS 再次洗滌后加入0.1% Triton X-100，用小鼠神經(jīng)微絲蛋白抗體（1:400）4℃孵育過夜，PBS 洗滌3次，采用FITC 標記山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育1 h，PBS 充分漂洗后，封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.4 SGCs凋亡的流式檢測

培養(yǎng)第5天狀態(tài)良好的SGCs細胞，分成2組，1組加入終濃度100 mg/L 的AGEs，另一組加入等體積PBS，作用2 h 后，加入sRAGE 維持其終濃度為0、50、100、150 mg/L，每組3個復孔。24 h后收集細胞，棄上清，沉淀重懸于100μL 反應緩沖液，加入5μL AnnexinV-FITC及10μL PI，避光孵育10min后上機檢測。

1.5 Western blot 技術檢測SGCs 凋亡相關蛋白Bax、BCL-2及caspase-3的表達情況

培養(yǎng)第5天狀態(tài)良好的SGCs細胞，分成2組，1組加入終濃度100mg/L 的AGEs，另一組加入等體積PBS，作用2 h 后，加入sRAGE 維持其終濃度為0、150 mg/L。24 h后收集不同處理組細胞，加入RIPA 裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF 以提取蛋白質(zhì)并測定濃度。取樣品100 μg 以12%的SDS-PAGE 電泳，常規(guī)轉膜，脫脂奶粉封閉，加一抗（Bax、BCL-2、caspase-3），4℃孵育過夜，采用TBST 洗脫10min×3次，二抗室溫孵育2 h后TBST洗脫10min×3次，ECL化學發(fā)光顯影。以GADPH作為內(nèi)參，重復3次。

1.6 RT-PCR 分析各實驗組SGCs 的RAGE mRNA的表達

收集胰蛋白酶消化培養(yǎng)第5 天SGCs，按照QIAGEN 說明書進行RNA 提取，收集RNA 樣品。RT-PCR 方法檢測RAGE 的mRNA 表達情況，應用Primer 5.0 軟件設計引物。PCR 引物序列如下：5'-GGACCCTTAGCTGGCACTTAGA-3'（上 游 引物）；5'-GAGTCCCGTCTCAGGGTGT-CT-3'（下游引物）。以GADPH 為內(nèi)參基因，序列如下：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'（ 上 游 引物）；5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'（下游引物）。反應條件為95℃2min，95℃30s，60℃30s，72℃45s，共計40個循環(huán)。采用2△△CT法計算原始CT值數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 SGCs的培養(yǎng)及鑒定

小鼠耳蝸SGCs 體外培養(yǎng)過程：培養(yǎng)24 h 后細胞大量貼壁，開始出現(xiàn)胞體折光性較強含短小突起的雙極細胞及胞體形態(tài)各異的細胞（圖1-AⅠ）。阿糖胞苷處理48 h后，可見軸突延長的雙極神經(jīng)元細胞（圖1-AⅡ）。培養(yǎng)4-7 天，神經(jīng)元突起變長，部分胞體周邊可見光暈、胞核，呈現(xiàn)典型雙極神經(jīng)元細胞形態(tài)，部分SGCs 存有一個或多個神經(jīng)突起。同時一些相鄰的神經(jīng)元逐漸交織成網(wǎng)狀結構（圖1-AⅢ、圖1-AⅣ）。免疫熒光結果：NF 陽性細胞細胞體呈橢圓形梭形。熒光顯微鏡下見細胞體區(qū)域及軸突呈綠色熒光，軸突熒光較弱。成纖維細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞均未染色（圖1-B）。

圖1 SGCs 的培養(yǎng)及鑒定；（A）Ⅰ為SGCs 培養(yǎng)24h，出現(xiàn)雙極細胞；Ⅱ為阿糖胞苷作用48h SGCs，可見雙極神經(jīng)元細胞軸突延長；Ⅲ為培養(yǎng)第5 天SGCs，典型雙極神經(jīng)元細胞形態(tài)；Ⅳ為培養(yǎng)第7天SGCs，相鄰的神經(jīng)元逐漸交織成網(wǎng)狀結構（×200，“ →”指示為SGC細胞）。（B）Ⅰ為明場視野，Ⅱ為熒光視野下SGCs的NF200免疫熒光染色（×200）。Fig. 1 Culture and identification of SGCs；(A) Ⅰshows SGCs cultured for 24h, appear bipolar cells； Ⅱshows SGCs with cytarabine exposed for 48 h,the axons of bipolar cells extending； Ⅲshows SGCs cultured for 5 days, typical bipolar neurons formed；Ⅳshows SGCs cultured for 7 days, adjacent neurons interwoven into mesh gradually； (×200，“ →”instruction for SGCs).(B)Ⅰfor bright field,Ⅱfor immunofluorescence of NF200 in SGCs(×200).

2.2 AGEs、sRAGE對SGCs凋亡率的影響

不同濃度的sRAGE 處理SGCs 細胞（加入PBS及AGE 預處理組），加入AGEs 組細胞凋亡率明顯增加，單純加入AGEs組相較PBS組，細胞凋亡率由（6.17±1.13）%增加至（17.15±2.27）%，組間差異有統(tǒng)計學意義（t=7.5,P＜0.05）；sRAGE 作用24h 后，加入AGEs 預處理組的細胞，細胞凋亡分別為（17.15±2.27）%、（14.38±1.16）%、（11.44±1.21）%和（4.98±1.31）%，即 在0-150mg/L 范 圍 內(nèi)，隨 著sRAGE濃度增高，SGCs細胞凋亡率逐漸減少，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=33.8,P＜0.05）；而加入PBS的空白對照組，細胞凋亡率分別為（6.17±1.13）%、（6.54±1.08）%、（7.04±2.19）%和（6.67±1.33）%，即在0-150mg/L 范圍內(nèi)，隨著sRAGE 濃度增高，SGCs細胞凋亡率無明顯升高少，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 不同濃度sRAGE 對PBS 及100 mg/L AGE 預處理的SGCs 凋亡率的影響；不同濃度的sRAGE ( 0mg/L、50mg/L、100 mg/L、150 mg/L)作用于PBS及AGE預處理的SGCs細胞24；(A)細胞采用Annxin V-FITC/PI染色，流式細胞術檢測細胞凋亡率；(B)細胞凋亡率的柱狀統(tǒng)計圖；*P＜0.05，**P＜0.01。Fig.2 Effect of different concentration of sRAGE on apoptosis of SGCs pretreated with PBS and 100 mg/L AGE. The SGCs with PBS and AGE exposed were treated with different concentration of sRAGE (0mg/L, 50mg/L, 100 mg/L and 150 mg/L) for 24 h. (A) Cell apoptosis rates were detected by Annexin V-FITC/PI, then determined by flow cytometry. (B)The column charts of apoptosis rate；*P＜0.05,**P＜0.01.

2.3 AGEs、sRAGE 對SGCs 凋 亡 相 關 蛋 白Bax、BCL-2及caspase-3的影響

不同濃度的sRAGE 處理SGCs（加入PBS 及AGE 預處理組），western blot 檢測發(fā)現(xiàn)：加入AGEs組細胞相較加入PBS 組，凋亡蛋白Bax 及cleaved caspase-3 表達上調(diào)，抗凋亡蛋白BCL-2 表達下調(diào)(t=12.33,P=0.002)；這表明加入AGEs 將促進SGCs的凋亡。而加入sRAGE后，AGEs預處理組細胞較未加入sRAGE 組BCL-2 表達上調(diào)(t=12.33,P=0.002)，凋亡蛋白Bax 及cleaved caspase-3 表達下調(diào)，這表明sRAGE 能有效減少AGEs 誘導SGCs 凋亡；加入PBS 組SGCs 在加入sRAGE 后，凋亡相關蛋白Bax、BCL-2 及caspase-3 均未見明顯改變，表明sRAGE在正常培養(yǎng)的SGCs中，對細胞凋亡影響不大；在AGEs 誘導凋亡的SGCs 細胞組，可以阻斷AGEs-RAGE信號途徑，有效減少的細胞的凋亡。

圖3 sRAGE 作用于PBS 及AGE 預處理的SGCs 細胞24h；（A）Western blot 技術檢測sRAGE 對SGCs 凋亡相關蛋白Bax、BCL-2及caspase-3的影響；（B）圖（A）中的蛋白相對灰度值；*P＜0.05。Fig. 3 The SGCs with PBS and AGE exposed were treated with sRAGE for 24h；(A)Effect of Srage on apoptosis-related proteins of SGCs with PBS and AGE exposed or not by Western blot.(B)Relative expression levels of BCL-2,Bax and caspase-3 in SGCs with PBS and AGE exposed or not.*P＜0.05.

2.4 RT-PCR 分析各實驗組SGCs 的RAGE mRNA的表達情況

不同濃度的sRAGE 處理SGCs（加入PBS 及AGE 預處理組），RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)：加入AGEs 組細胞相較加入PBS組，細胞膜表面受體RAGE表達升高；在AGEs 預處理組，sRAGE 的濃度增加與RAGE 的表達呈負相關（F=37.79,P＜0.05），而在PBS 處理組中，逐漸增加sRAGE 的濃度，RAGE 表達量差異不大（P＞0.05）。表明sRAGE 可能還阻斷了RAGE-配體信號介導的正反饋機制而減少膜上受體的表達。

圖4 sRAGE 作用于PBS 及AGE 預處理的SGCs 細胞24h；（A）RT-PCR檢測sRAGE作用SGCs后各組RAGE mRNA表達量；（B）各組SGCs RAGE 的mRNA 表達情況，**P＜0.05，**P＜0.01；（C）SGCs中RAGE的DNA瓊脂糖凝膠電泳情況；（D）圖（C）中的相對灰度值；*P＜0.05，**P＜0.01。Fig. 4 The SGCs with PBS and AGE exposed then treated with sRAGE for 24h； (A) The expression levels of RAGE in SGCs by RT-PCR； (B) The column charts of RAGE mRNA expression；*P＜0.05，**P＜0.01. (C) The expression levels of RAGE in SGCs by SDS-AGE. (D) Relative expression levels of RAGE in SGCs.**P＜0.01.

3 討論

臨床所說老年性耳聾大多是指耳蝸內(nèi)毛細胞和SGCs 損失及聽力中樞功能減退引起的聽力損失。SGCs 作為聽力傳導通路的一級中樞，其在耳蝸內(nèi)存活的數(shù)量的缺失將直接導致老年性耳聾的發(fā)生。因此有效減少或者遏制SGCs 的死亡，可能可以有效干預老年性耳聾的發(fā)生和發(fā)展。同時也為部分無法使用助聽器或拒絕使用助聽器的老年聾患者提供了新的可能[9]。

研究證實RAGE是一種多配體的受體，通過與配體結合后，激活MAPK 等多種細胞信號轉導途徑，誘導激活NF-κB，促使IL-1a、IL-6、TNF-α和細胞間粘附分子等損傷因子的表達；通過NADPH 氧化酶的激活導致活性氧自由基的增多，進而誘導NF-κB 表達，形成正反饋機制[10,11]。RAGE 多配體的特性使它參與了包括神經(jīng)退行性疾病、慢性炎癥性疾病和老化等多種病理過程[12-15]。小鼠耳蝸毛細胞、SGCs和血管紋內(nèi)已被發(fā)現(xiàn)RAGE受體的表達，因此，著手于研究保護RAGE 介導的SGCs 不可逆凋亡是研究的思路。

在體內(nèi)，可溶性RAGE 受體（soluble forms of RAGE，sRAGE）來自于RAGE mRNA 的選擇性剪切；在小鼠中，sRAGE 則來源于RAGE 膜蛋白受體胞外段[16]。已有研究證實sRAGE可以作為RAGE信號軸介導的病理過程中的生物標志物[13,17]。同時，它還可以抑制RAGE信號軸引起的病理過程，具體機制可能是sRAGE類似“誘餌”干預了RAGE信號軸，通過競爭性結合RAGE的配體而不產(chǎn)生相應的生物學效應[8,14]。因此sRAGE在RAGE信號軸的干預可能可以作為老年性耳聾一種可靠的治療手段。

RAGE作為多配體受體，其表達量可影響SGCs的存活。我們通過RT-PCR 技術對RAGE 表達進行檢測，結果表明：AGEs可以促進RAGE受體的表達；AGEs 濃度不變，增加sRAGE 的濃度，RAGE 受體的表達逐漸減少，表明sRAGE 阻斷了RAGE-配體信號導致膜上受體的表達減少。

本研究分析了AGEs 及sRAGE 對SGCs 細胞凋亡的影響。結果證實AGEs 可以促進SGCs 的凋亡；sRAGE（0-150mg/L）可有效減少AGEs 誘導SGCs凋亡，sRAGE對正常培養(yǎng)的SGCs凋亡影響不大。因此，我們認為：AGEs 可以通過AGEs-RAGE信號軸誘導體外培養(yǎng)的SGCs凋亡。在暴露在同濃度AGEs的SGCs中，增加sRAGE的濃度，細胞凋亡減少，RAGE受體的表達逐漸減少。表明sRAGE可以減少AGEs-RAGE信號途徑誘導的細胞凋亡。

綜上所述，本研究結果證實了sRAGE 對正常SGCs 無影響，但可以有效減少AGEs 誘導的SGCs凋亡，降低細胞膜RAGE 的表達，為感音性老年性耳聾的防治提供了新思路。