生物卵膜促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合及病理觀察

李瑾 韓月臣 蔡晶

山東大學(xué)附屬山東省耳鼻喉醫(yī)院耳外科（濟(jì)南250022）

中耳膽脂瘤手術(shù)過程中經(jīng)常會(huì)涉及開放乳突腔，進(jìn)行大量骨質(zhì)的磨除以顯露病變，便于徹底切除和避免病變殘留復(fù)發(fā)。進(jìn)行乳突術(shù)腔的對(duì)外開放往往也是對(duì)于一些病例的有效處理方式，這些術(shù)腔的上皮化修復(fù)的速度和程度決定了術(shù)后干耳的時(shí)間。應(yīng)用不同材料覆蓋乳突術(shù)腔是促進(jìn)上皮化修復(fù)的有效手段，使用價(jià)格便宜且促進(jìn)皮膚修復(fù)創(chuàng)面的替代材料已成為迫切的需要。

生物卵膜，主要指雞蛋殼的白色內(nèi)膜，含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等，是自然界中一種天然的半透膜，有著許多獨(dú)特的生物學(xué)特性。目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用生物卵膜作為鼓膜貼補(bǔ)材料，發(fā)現(xiàn)可以明顯促進(jìn)鼓膜穿孔愈合[1,2]。本實(shí)驗(yàn)以6～8 周的健康雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，通過制備全層皮膚損傷創(chuàng)面，觀察生物卵膜對(duì)小鼠皮膚損傷的修復(fù)作用，為未來其可以用于人類中耳乳突術(shù)腔的創(chuàng)面修復(fù)提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性C57BL/6 小鼠100 只（由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，飼養(yǎng)于山東省耳鼻喉研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障環(huán)境（溫度20～23℃，濕度50%～60%）。1%戊巴比妥鈉，北京冬哥科技有限公司；4%多聚甲醛溶液、石蠟，上海振普生物科技有限公司；HH-W600數(shù)顯恒溫水浴箱（金壇市精達(dá)儀器制造廠）；HG-101-5電熱鼓風(fēng)干燥箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠）；LEICA-2135型旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；顯微鏡成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 造模與分組

將100 只健康雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為2mm 組和3mm 組，各50 只，采用1%戊巴比妥鈉按40mg/kg體質(zhì)量進(jìn)行腹腔麻醉，備皮、75%乙醇消毒背部，標(biāo)記，每只小鼠均通過眼科剪造成3 個(gè)分散分布的深及筋膜的直徑2mm 或3mm、相同大小的背部皮膚缺損創(chuàng)面，在將其隨機(jī)、平均分為5組，生物卵膜，生物卵膜+蛋清液，莫匹羅星，聚維碘酮，對(duì)照組。制備生物卵膜：取新鮮的雞蛋，將其擦干，敲破蛋殼使用無菌持物鉗將雞蛋的內(nèi)膜輕輕剝出。生物卵膜組在創(chuàng)面覆蓋生物卵膜，于邊角細(xì)線固定縫合一針，生物卵膜+蛋清液是在此基礎(chǔ)上每日涂抹新鮮蛋液于生物卵膜上方，莫匹羅星組不予生物卵膜覆蓋且每日早晨涂抹適量莫匹羅星一次，聚維碘酮組不予生物卵膜覆蓋且每日早晨涂抹適量聚維碘酮一次，對(duì)照組不予生物卵膜覆蓋且不涂抹藥物，每只小鼠的3個(gè)傷口確保有1個(gè)為對(duì)照，1個(gè)為生物卵膜覆蓋。連續(xù)給藥，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，每日觀察并做記錄，對(duì)比相同大小皮膚缺損的愈合情況，計(jì)算各組平均愈合時(shí)間。

1.3 創(chuàng)面愈合時(shí)間

每日觀察創(chuàng)面愈合情況。創(chuàng)面愈合判斷標(biāo)準(zhǔn)：創(chuàng)面痂皮脫落，新上皮生成。記錄各組動(dòng)物創(chuàng)面平均愈合天數(shù)。

1.4 組織病理學(xué)觀察

2mm組的小鼠于造模后12天注射過量麻藥處死，將愈合創(chuàng)面連同周邊部分正常皮膚一并取下，迅速置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液，按常規(guī)石蠟制片方法進(jìn)行脫水透明、石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm，蘇木精-伊紅染色（HE 染色），顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)均以表示，各組間用單因素方差分析比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)傷愈合的形態(tài)觀察

小鼠全層皮膚切除創(chuàng)傷，肌肉組織完全暴露，由于傷到皮膚中的毛細(xì)血管，會(huì)少量出血，但很快止住。生物卵膜在創(chuàng)面上的覆蓋時(shí)間保證在4～5天。術(shù)后第6 天，各組肉芽組織明顯增多，呈深紅色，可見毛細(xì)血管及創(chuàng)面收縮，創(chuàng)腔逐漸被肉芽組織填平，創(chuàng)緣新生上皮生長(zhǎng)明顯，創(chuàng)緣可見瘢痕組織形成。生物卵膜組和聚維碘酮組顏色較對(duì)照組皮膚淺，無毛發(fā)生長(zhǎng)，創(chuàng)面為肉芽組織覆蓋，創(chuàng)緣新皮較薄，透明，逐漸縮小呈瘢痕愈合。生物卵膜+蛋清液組和莫匹羅星組創(chuàng)面較紅，伴有水腫。對(duì)照組創(chuàng)面痂皮覆蓋明顯。術(shù)后第12 天，2mm 組的對(duì)照組創(chuàng)面仍處于增殖修復(fù)期，新長(zhǎng)出的表皮向創(chuàng)面中心爬行，逐漸覆蓋創(chuàng)面，其余四組創(chuàng)面上皮化明顯、收縮明顯，生物卵膜組和聚維碘酮組基本愈合，瘢痕淡化，修復(fù)完全，幾乎看不到創(chuàng)面痕跡。3mm組除生物卵膜組和聚維碘酮組完全愈合，其余三組尚未愈合。

2.2 小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合時(shí)間

2mm 組：對(duì)照組的愈合時(shí)間為（13.40.52）d，生物卵膜+蛋清液組和莫匹羅星組的愈合時(shí)間較對(duì)照組略短（P＜0.05），生物卵膜組和聚維碘酮組的愈合時(shí)間最短（P＜0.05），分別為（8.30.48）d、（8.50.53）d，這兩組愈合時(shí)間沒有差別（表1，圖1A）。3mm 組：對(duì)照組的愈合時(shí)間最長(zhǎng)，為（14.50.71）d，生物卵膜+蛋清液組和莫匹羅星組的愈合時(shí)間沒有差別，且較對(duì)照組略短（P＜0.05），與2mm 組不同的是，生物卵膜組和聚維碘酮組的愈合時(shí)間顯示出差別，生物卵膜組愈合時(shí)間最短（P＜0.05），為（10.60.52）d，聚維碘酮組愈合時(shí)間較生物卵膜組略長(zhǎng)（P＜0.05），但較其余三組均短（P＜0.05）（表1，圖1B）。

圖1 小鼠皮膚直徑2mm、3mm 的創(chuàng)面愈合時(shí)間比較（*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與生物卵膜組比較，P＜0.05）Fig. 1 Comparison of wound healing time of mouse skin diameter 2 mm and 3 mm（P＜0.05 by oneway ANOVA compared with the control(*)and the biological egg membrane(#)group）.A 在2mm 組中，四組干預(yù)創(chuàng)面愈合時(shí)間與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），生物卵膜組和聚維碘酮組創(chuàng)面愈合時(shí)間最短但兩者之間無差異（P＞0.05）。B在3mm組中，四組干預(yù)創(chuàng)面愈合時(shí)間與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），生物卵膜組愈合時(shí)間最短（P＜0.05），且較聚維碘酮組愈合時(shí)間短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A In the 2 mm group, there was significant difference in the wound healing time between the four groups and the control group (P＜0.05). The wound healing time was the shortest in the biological egg membrane group and the Iodophor group,but there was no difference between the two groups (P＞0.05). B In the 3 mm group, there was significant difference in the wound healing time between the four groups compared with the control group (P＜0.05). The biological egg membrane group had the shortest healing time (P＜0.05), which was shorter than that of the Iodophor group. The difference was statistically significant(P＜0.05).

2.3 創(chuàng)面組織學(xué)觀察結(jié)果

正常皮膚呈現(xiàn)表皮、真皮及皮下組織分布；組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞分層清晰，真皮層可見波浪狀纖維組織，無卷曲扭結(jié)，排列有序，分布均勻，真皮內(nèi)汗腺、皮脂腺及毛囊大小、形態(tài)規(guī)則（圖2A）。

對(duì)照組原損傷區(qū)被覆表皮再生，表皮細(xì)胞層厚薄不一，上皮細(xì)胞大小形態(tài)及排列欠規(guī)則。真皮層肉芽組織及纖維組織增生，皮膚附屬器減少（圖2F）。

生物卵膜組原損傷區(qū)被覆表皮再生，表皮細(xì)胞層較薄，上皮細(xì)胞形態(tài)及排列尚規(guī)則。真皮層肉芽組織及纖維組織增生，汗腺及毛囊等皮膚附屬器盡管較正常皮膚組減少，但比其他四組明顯多，較接近正常皮膚組織（圖2B）。

表1 各組小鼠創(chuàng)面平均愈合時(shí)間比較（±s）Table 1 Comparison of average wound healing time in each group of mice(±s)

表1 各組小鼠創(chuàng)面平均愈合時(shí)間比較（±s）Table 1 Comparison of average wound healing time in each group of mice(±s)

P＜0.05 by oneway ANOVA compared with the control(*)

Group Biological egg membrane Biological egg membrane+egg white solution Mupirocin Iodophor Control n 10 10 10 10 10 Mean healing time（d）Group 2mm 8.3±0.48*11.5±0.71*11.6±0.52*8.5±0.53*13.4±0.52 Group 3mm 10.6±0.52*12.8±0.63*12.5±0.71*11.8±0.63*14.5±0.71

生物卵膜+蛋清液組原損傷區(qū)被覆表皮完全再生，表皮細(xì)胞層增厚，排列尚規(guī)則，真皮層肉芽組織及纖維組織增生，皮膚附屬器減少（圖2C）。

莫匹羅星組原損傷區(qū)被覆表皮再生，表皮細(xì)胞層較薄，上皮細(xì)胞大小形態(tài)不一，排列欠規(guī)則，真皮層肉芽組織及纖維組織增生，皮膚附屬器減少（圖2D）。

聚維碘酮組原損傷區(qū)被覆表皮再生，表皮細(xì)胞層較薄伴角化過度，真皮層肉芽組織及纖維組織增生，毛囊減少（圖2E）。

圖2 術(shù)后12天各組創(chuàng)面組織學(xué)觀察（×100）Fig. 2 Histological observation of wound surface in each group 12 days after operation(×100)A 正常皮膚組織結(jié)構(gòu)完整。B生物卵膜組上皮細(xì)胞形態(tài)及排列尚規(guī)則，皮膚附屬器較接近正常。C生物卵膜+蛋清液組表皮細(xì)胞層增厚，皮膚附屬器減少。D 莫匹羅星組細(xì)胞排列欠規(guī)則，皮膚附屬器減少。E 聚維碘酮組表皮細(xì)胞層角化過度，毛囊減少。F 對(duì)照組細(xì)胞大小形態(tài)及排列欠規(guī)則，皮膚附屬器減少(×100)。A Normal skin tissue structure is intact. The morphology and arrangement of epithelial cells in group B were regular, and the skin appendages were close to normal.In group C,the epidermal cell layer was thickened and the skin appendages were reduced. D In the mupirocin group, the arrangement of cells was less regular and the skin appendages were reduced. Hyperkeratosis of the epidermal cell layer and reduction of hair follicles were observed in the E Iodophor group.In the F control group, the size, morphology and arrangement of the cells were lessregular,and the skin appendages were reduced(magnification×100).

3 討論

全層缺損創(chuàng)面可以模擬臨床上常見的皮膚缺損。探索促進(jìn)缺損創(chuàng)面愈合的治療措施，對(duì)臨床上治療創(chuàng)傷、潰瘍等皮膚缺損有較好的指導(dǎo)意義。創(chuàng)傷愈合是一復(fù)雜的生物學(xué)過程，深二度創(chuàng)傷所致的皮膚全層缺損創(chuàng)面必須進(jìn)行自體皮膚移植才能修復(fù)，但由于患者供皮區(qū)有限，特別是在耳廓、外耳道、中耳乳突術(shù)后骨質(zhì)裸露區(qū)域，自體皮膚移植修復(fù)創(chuàng)面一直受到限制。因此，使用其他類型的皮膚替代物來促進(jìn)創(chuàng)面愈合已成為迫切的需要。本研究中，我們建立小鼠皮膚全層缺損創(chuàng)面模型，發(fā)現(xiàn)生物卵膜對(duì)皮膚缺損愈合有促進(jìn)作用。

生物卵膜氨基酸含量較高，抗原性弱，是一種接近生理狀態(tài)的半透膜，是良好的天然生物性敷料。使用它貼敷在傷口能保護(hù)創(chuàng)面，預(yù)防和控制感染，促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，同時(shí)又能改善局部滲透壓，減少滲出，給創(chuàng)面營(yíng)造一個(gè)低氧、微酸、相對(duì)無菌、適度濕潤(rùn)的微環(huán)境，而且還提供了有利于細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和創(chuàng)面愈合[3]。本研究結(jié)果顯示，在2mm組即小傷口中，與對(duì)照組相比，生物卵膜組和聚維碘酮組創(chuàng)面肉芽組織形成較早，愈合時(shí)間最短。生物卵膜+蛋清液組的愈合時(shí)間略長(zhǎng)，但優(yōu)于對(duì)照組的愈合。蛋清液未體現(xiàn)修復(fù)優(yōu)勢(shì)可能與蛋清液讓傷口潮濕，不利于創(chuàng)面恢復(fù)有關(guān)。莫匹羅星組的愈合情況與生物卵膜+蛋清液組相類似，莫匹羅星的抗菌效果也未見明顯優(yōu)勢(shì)，說明抗感染在小鼠皮膚愈合過程中不是最重要的因素。而在3mm 組即略大的傷口中，發(fā)現(xiàn)與2mm組明顯不同的現(xiàn)象，生物卵膜組和聚維碘酮組的愈合時(shí)間顯示出差別，生物卵膜組愈合時(shí)間最短（P＜0.05），聚維碘酮組愈合時(shí)間較生物卵膜組略長(zhǎng)（P＜0.05），但較其余三組均短（P＜0.05）。這說明生物卵膜在略大的創(chuàng)面中起到了橋梁、支架作用，利于增生移行的上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。

創(chuàng)傷愈合的修復(fù)過程中一般會(huì)先發(fā)生局部炎癥反應(yīng)，繼而形成肉芽組織并不斷增生，隨后新生組織不斷地再生、重建修復(fù)。在全層缺損創(chuàng)面中毛囊等附屬器成分及基底層都被破壞，僅靠創(chuàng)面周緣細(xì)胞遷移和肉芽組織形成來填充創(chuàng)面，則速度進(jìn)行緩慢，甚至難以愈合。本研究中，生物卵膜組愈合最快，病理見上皮細(xì)胞形態(tài)及排列尚規(guī)則，皮膚附屬器較其余四組豐富，接近正常皮膚組織形態(tài)，病理與肉眼觀察相符合。這充分證明了生物卵膜具備明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合的優(yōu)點(diǎn)，有望大量應(yīng)用于皮膚損傷修復(fù)。

中耳乳突手術(shù)術(shù)中遺留的廣泛術(shù)腔骨質(zhì)裸露，如果進(jìn)行開放處理，則需要長(zhǎng)時(shí)間的周圍上皮移行進(jìn)行骨質(zhì)的覆蓋。在感染狀態(tài)下，肉芽的形成會(huì)延長(zhǎng)上皮化所需的時(shí)間。生物卵膜的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的特點(diǎn)，使得生物卵膜有可能作為術(shù)腔移植覆蓋物，覆蓋于乳突術(shù)腔的骨面，減少骨面裸露形成的肉芽，有助于周圍上皮移行，縮短上皮化時(shí)程，生物卵膜在皮膚損傷后的修復(fù)能力，也提示了生物卵膜未來在中耳乳突術(shù)腔應(yīng)用的潛能和方向。

本研究中，我們未選取耳部區(qū)域造模，是因?yàn)樾∈蠖繀^(qū)域狹窄，且不易固定生物卵膜，當(dāng)其頭部活動(dòng)時(shí)生物卵膜極易脫落，而背部皮膚平坦，面積較大，固定牢靠，所以我們?cè)诒巢繀^(qū)域建模。

盡管小鼠皮膚和人的皮膚存在差別，生物卵膜的療效在臨床中需進(jìn)一步驗(yàn)證，但本實(shí)驗(yàn)中生物卵膜可以明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合，且其取材方便、價(jià)格便宜，切實(shí)為臨床皮膚損傷修復(fù)提供新的治療方向。下一步，我們將在臨床耳科手術(shù)中展開研究，期待能為中耳乳突術(shù)腔創(chuàng)面修復(fù)提供新的治療方法。