339例非綜合征型耳聾患者致病基因突變分析

李俎怡 何蓉

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科

耳聾是最常見的感覺神經(jīng)性疾病，也是常見的小兒出生缺陷之一。遺傳性耳聾可分兩類：非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）和綜合征型耳聾(syndromic hearing loss，SHL）。遺傳性耳聾大約70%不伴有其它臨床表現(xiàn)或疾病的為NSHL。另外大約30%伴有其它臨床表現(xiàn)或疾病則為SHL[1]。耳聾病因復(fù)雜多變，可以由遺傳基因突變引起，也可由環(huán)境因素所致，其中大約60%的耳聾與遺傳因素有關(guān)[2]。耳聾病因復(fù)雜,影響因素多，且有200 余種目前已知的耳聾基因[3]，雖然導(dǎo)致耳聾的基因多種多樣，但是絕大多數(shù)遺傳性耳聾只與少數(shù)幾個基因突變有關(guān)。我國遺傳性耳聾主要是由GJB2，SLC26A4，12SrRNA 和GJB3 耳聾基因引起[4]。經(jīng)典的遺傳學(xué)認(rèn)為，生物的遺傳信息儲存在DNA 的堿基序列即一級結(jié)構(gòu)中，一級結(jié)構(gòu)的改變有時會導(dǎo)致生物產(chǎn)生可遺傳變異?；虻倪z傳方式包括常染色體顯性、常染色體隱性、X 隱性或者線粒體遺傳[5]，我國遺傳性耳聾的主要致病基因中12SrRNA 基因的遺傳方式為線粒體母系遺傳，而GJB3 基因通常遵循常染色體顯性遺傳模式，而GJB2基因和SLC26A4基因確認(rèn)是常染色體隱性遺傳性NSHL的基礎(chǔ)，這兩種致病基因?yàn)榧兒匣驈?fù)合突變時則被認(rèn)為是由耳聾基因突變引起的NSHL，這兩種致病基因?yàn)閱坞s合突變時則被認(rèn)為是突變基因攜帶者。隨著耳聾基因研究的深入及分子生物診斷技術(shù)的發(fā)展，遺傳性聾的分子遺傳學(xué)研究取得了飛速的發(fā)展，耳聾基因檢測已逐漸成為常規(guī)的檢測項(xiàng)目。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本實(shí)驗(yàn)研究對象選自2013 年1 月至2018 年10月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院就診的非綜合征性耳聾患者339 例，患者大部分來自于東北地區(qū)。其中男176 例，女163 例，年齡范圍從2 月-69歲，平均年齡15.42 歲，每個年齡層占比：＜1 歲:1～10 歲: 10～20 歲: 20～30 歲: 30～40 歲: 40～50 歲: 50～60歲:～60歲的比例分別為62:119:27:66:48:4:6:7。經(jīng)病史采集、體格檢查、聽力學(xué)以及影像學(xué)檢查，均確診為非綜合征型感音神經(jīng)性聾，均由本人或者監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取方法

受檢對象每人采集外周血5ml 備用，采用UPure Blood DNA PLUS Kit 血基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。操作步驟如下：1.向15ml 離心管中加入5ml 全血，5mlBuffer LRBC。2.上下顛倒混勻5min，直至液體澄清透明；12000rpm 離心5min，棄上清。3.往沉淀中加入800ulBuffer LWB,用移液槍將細(xì)胞團(tuán)吹打散開并全部移至另一新的2ml 離心管中。4.加入200ul BioBase Blood Beads，渦旋混勻，室溫孵育10min,每2-3min渦旋混勻。5將離心管置于磁力架上靜置1min后移除上清。將離心管從磁力架上取下，加入800ul Buffer LWB 清洗磁珠，渦旋混勻1min。6.重復(fù)三次步驟5 操作后，用移液器移除殘留液體，將離心管置于室溫處理5-10 分鐘以晾干磁珠。7.將離心管從磁力架上取下，加入至少300ul 洗脫液（TE 或EL），渦旋混勻，65 度孵育10min。8.將離心管置于磁力架上，待液體徹底澄清后，將上清液轉(zhuǎn)移致干凈的離心管中。提取的RNA樣應(yīng)保存于-20度。

1.2.2 DNA測序檢測

采用DNA測序技術(shù)，對4個熱點(diǎn)耳聾基因進(jìn)行檢測，其中GJB2，GJB3 基因采用全基因組測序；SLC26A4，及線粒體12srRNA 基因則采用對其常見的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)SLC26A4(PDS)(IVS7-2A＞G(919A＞G),2168A＞G)，12SrRNA(A1555G,C1494T)。進(jìn)行檢測。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，用自帶軟件進(jìn)行結(jié)果的判讀。

2 結(jié)果

339 例患者中共檢出發(fā)生耳聾相關(guān)基因突變患者114 例，總檢出率為33.63%（114/339），其中66 例GJB2 基因突變（19.46%, 66/339）；7 例GJB3基因突變（2.06%，7/339）；39 例SLC26A4 基因突變(11.50%，39/339)；4 例12srRNA 基因突變(0.88%, 4/339)。GJB2 基因檢出14 個突變位點(diǎn)，SLC26A4 基因檢出2個突變位點(diǎn)，GJB3基因檢測出3個突變位點(diǎn)，12SrRNA基因檢測出1個位點(diǎn)突變。一共有62例單雜合突變?yōu)閿y帶耳聾致病基因的患者；30 例純合突變，6例單雜合突變，16例復(fù)合突變，共52例為由致病基因突變致聾的患者（表1，2）。

2.1 由基因突變引起耳聾患者常見致病基因檢測結(jié)果

表1 52例由耳聾基因突變引起耳聾患者常見致病基因檢測結(jié)果（陽性）Table 1 Detection results of common pathogenic genes in 52 patients with deafness caused by deafness gene mutation(positive)

如表1所示，339例患者中共檢測出52例由基因突變引起非綜合征型耳聾患者。其中29例測出由GJB2 基因突變引起的，其致病突變構(gòu)成比為8.55%（29/339）；13例由SLC26A4基因突變引起的，其致病突變構(gòu)成比為3.83%（13/339）；6 例由GJB3基因突變引起，其致病突變構(gòu)成比為1.76%（6/339）；4例由12SrRNA基因突變引起的，其致病突變構(gòu)成比為1.18%（4/339）。在52例由基因突變引起非綜合征性耳聾患者中，由GJB2 基因突變引起耳聾的比例為55.77%（29/52），由SLC26A4 基因突變引起耳聾的比例為25%（13/52），由GJB3 基因突變引起耳聾的比例為11.54%（6/52），由12SrRNA基因突變引起耳聾的比例為7.69%（4/52）。GJB2 基因包含2 種突變方式，其中純合突變14 例，突變位點(diǎn)分別為c.235delC，c.176dell6bpc，c.368C＞A，所占比例分別為23.08%（12/52），7.69%（4/52），7.69%（4/52）；復(fù)合突變15例，突變位點(diǎn)為c.235delC/c.299-300delAT 6 例，所占比例為11.54%（6/52）；c.235delC/c.109G＞A 2例，所占比例為3.85%（2/52）；突變位點(diǎn)為c.235delC/c.508-509delTT，c.235delC/c.608T＞C，c.235delC/c.439G＞A，c.109G＞A/c.608T＞C，c.299-300delAT/605-60·6ins46bp 均為1 例，所占比例均為1.92%（1/52）；其中有兩例為兩個致病基因復(fù)合突變，其突變位點(diǎn)分 別 為GJB2（c.235delC）/GJB3(c.547G＞A)1 例，所占比例均為1.92%（1/52），GJB2（c.235delC）/SLC26A4(919A＞G 雜合），1 例，所占比例均為1.92%（1/52）。GJB3 基因僅有1 種突變方式，即單雜合突變，突變位點(diǎn)有3 個，其中由c.580G＞A 突變位點(diǎn)引起突變的有3 例，所占比例5.57%（3/52）；c.538C＞T 突變位點(diǎn)2 例，所占比例3.85%（2/52）；c.250G＞A 突變位點(diǎn)1 例，所占比例1.92%（1/52）。SLC26A4基因包含2種突變方式，其中純合突變12例，突變位點(diǎn)為c.919A＞G，所占比例為23.08%（12/52）；復(fù)合突變1 例，突變位點(diǎn)為c.919A＞G/c.2168A＞G 所 占 比 例 均 為1.92%（1/52）。12SrRNA 基因僅檢測到1 種突變位點(diǎn)為1555A＞G的純合突變，所占比例均為7.69%（4/52）。

表2 62例攜帶耳聾致病基因患者常見致病基因檢測結(jié)果（陽性）Table 2 Detection results of common pathogenic genes in 62 patients with deafness-causing gene(positive)

2.2 攜帶致病基因患者常見致病基因檢測結(jié)果

如表2 所示，339 例非綜合征型耳聾患者中共檢測出62 例為攜帶致病基因的患者。其中攜帶GJB2 基因突變的有37 例，攜帶SLC26A4 基因突變的有25例。在62名攜帶致病基因突變的耳聾患者中，由GJB2 基因突變的患者的比例為59.68%（37/62），由SLC26A4 基因突變的患者的比例為40.32%（25/62）。所有所攜帶致病基因患者中的致病基因的突變方式均為單基因雜合突變。GJB2基因檢測出的突變位點(diǎn)有10 個，其中在c.235delC 突變位點(diǎn)發(fā)生突變的有12 例，所占比例19.35%（12/62）；c.299-300delAT突變位點(diǎn)7例，所占比例11.29%（7/62）；c.109G＞A 突變位點(diǎn)6 例，所占比例9.67%（6/62）；c.608T＞C 突變位點(diǎn)6 例，所占比例9.67%（6/62），其余突變位點(diǎn)為c.238C＞A，c.19C＞A，c.680T＞C，c.35insG，c.368C＞A，c.344T＞G 均1 例，所占比例均為1.61%（1/62）。SLC26A4基因檢測出的突變位點(diǎn)有2個，其中c.919A＞G突變位點(diǎn)23例，所占比例37.1%（23/62）；c.2168A＞G突變位點(diǎn)2例，所占比例3.23%（2/62）。

3 討論

耳聾基因在遺傳性耳聾患者中具有較高的遺傳異質(zhì)性，不同地區(qū)和不同人群中耳聾基因的突變頻率、突變方式和熱點(diǎn)突變有很大差異，且不同地域、不同民族有其自身特點(diǎn)。根據(jù)國內(nèi)學(xué)者流行病學(xué)研究結(jié)果，在遺傳性感音神經(jīng)性聾患者中，42.41%能夠檢測出相關(guān)耳聾基因突變[6]。國內(nèi)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查顯示,21%的感音神經(jīng)性聾患者攜帶GJB2基因突變，14.5%的患者攜帶SLC26A4基因突變，3.8%患者攜帶線粒體m.155A＞G[7]。本研究中339 例非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患者通過DNA 測序共檢出114 例患者發(fā)生耳聾相關(guān)基因突變，檢出率為33.63%（114/339），其中66 例GJB2基因突變（19.47%, 66/339）；7 例GJB3 基因突變（2.06%，7/339）；39 例SLC26A4 基因突變(11.50%，39/339)；4 例12srRNA 基因突變(0.88%, 4/339)。本研究中，非綜合征性耳聾患者中GJB2 基因突變檢出率和SLC26A4 基因突變檢出率與全國平均水平大致相等；但4個常見耳聾致病基因突變總檢出率和12srRNA基因突變檢出率較全國平均水平稍低，其原因可能是因?yàn)闃颖玖坎粔虼?，分布較廣，尚不能集中說明東北的發(fā)病情況。

遺傳性耳聾是臨床上比較常見的遺傳病之一，它的發(fā)生主要是由基因突變引起[8]。由基因突變引起的遺傳性耳聾患者會將該致病基因突變穩(wěn)定的遺傳給后代，而耳聾致病基因攜帶者患者將該致病基因突變遺傳給后代的幾率則減少一半，因此查明遺傳性耳聾是否由基因突變引起的，對于遺傳性耳聾的診斷，防治具有重要的意義。本次研究納入的339 例非綜合征耳聾患者中52 例是由基因突變引起耳聾患者，62例為攜帶致病基因的患者，其占非綜合征型耳聾患者的比例分別為15.33（52/339）和18.28%（62/339），其結(jié)果與田穎[9]報道的遼寧地區(qū)基因突變引起耳聾患者和攜帶致病基因患者，其占非綜合征型耳聾患者的比例均為20.03%相比，本次研究攜帶致病基因的耳聾患者占比大致相等，而基因突變致聾患者占比減少。

GJB2基因是致聾的第一大耳聾基因。不同人群、不同地域間基因致病突變率及突變熱點(diǎn)各異。本研究中GJB2 致病突變率為8.55%，與西北地區(qū)報道的GJB2致病突變率9.55%相比大致相等[10]，但低于全國GJB2總體致病突變率12.88%[11]。東亞人群中以235delC 最為多見，而在白種人群和阿拉伯人群中則以235delG 為最常見的突變類型[12]。SLC26A4 基因是我國第二位高發(fā)的致聾基因。至今已報道有近200種SLC26A4基因的致病突變，其突變譜在不同的地區(qū)和種族中存在差異[13]。在亞洲，H723R 在日本人群中占有最高比例[14]，而中國人群中以c.919-2A＞G 最為常見[15]。在本次研究中不論是致病基因突變患者還是攜帶耳聾致病基因患者中GJB2 均是最常見的突變基因，其次為SLC26A4 基因，這與田穎[9]等報道的遼寧地區(qū)非綜合征型耳聾患者常見耳聾基因突變分析結(jié)果一致，且235delC 為GJB2 基因最常見的突變類型，c.919-2A＞G 為SLC26A4 基因最常見的突變類型。而在本次研究中GJB3基因突變只存在于6例攜帶耳聾致病基因的患者中，12sRNA 基因突變只存在于4 例由基因突變引起耳聾患者中，c.580G＞A 為GJB3 基因突變主要形式，1555A＞G 為12srRNA 基因突變主要形式。這兩種基因突變率均高于田穎[9]等對于遼寧地區(qū)非綜合征型耳聾患者GJB3基因突變和12sRNA基因突變率為0的報道。GJB2基因和SLC26A4基因遵循常染色體隱性遺傳，常發(fā)生多態(tài)性改變。基因的多態(tài)性改變不與遺傳性狀共伴隨，是指人群中個體的DNA 分子結(jié)構(gòu)改變，但基因的表達(dá)形狀及功能不改變。多態(tài)性改變單獨(dú)出現(xiàn)均不引起病變[10]。GJB2 基因和SLC26A4 基因的單雜合突變并不能引起病變，只能明確患者攜帶此突變基因，是突變基因攜帶者。而這兩個基因的純合和復(fù)合突變則被認(rèn)為具有致病性，此類患者則被認(rèn)為是由耳聾基因突變引起的NSHL。因此，將致病基因檢測結(jié)果分別在攜帶耳聾致病基因患者和耳聾基因突變引起耳聾患者中進(jìn)行討論，探討耳聾基因的突變方式及突變位點(diǎn)對耳聾患者的致病性則對明確耳聾患者的病因，采取的治療方案及預(yù)防后代遺傳性耳聾的具有重要的意義。

DNA 測序技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中常用的一種技術(shù)手段。具有高通量、低成本、高準(zhǔn)確性、高敏感性及高特異性的優(yōu)點(diǎn)，顯著提高了耳聾基因的診斷率。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger 等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam 及Gilbert 發(fā)明的化學(xué)降解法。運(yùn)用最多的是Sanger測序法，即一代測序?，F(xiàn)Sanger測序技術(shù)的測序長度可達(dá)1000bp，堿基的讀取準(zhǔn)確率達(dá)99.99%，已成為測序的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管Sanger 測序技術(shù)已經(jīng)提高了DNA 測序的速度,但是在費(fèi)用和效率上仍有不足。高通量、成本低的下一代測序(next generation sequencing,NGS)技術(shù)的誕生這使耳聾基因研究和基因診斷步入一個新的高速發(fā)展階段。NGS技術(shù)具有高通量和低單堿基成本的特點(diǎn),但是測序讀長相對較短是第二代測序技術(shù)的主要缺陷。為了更好地發(fā)掘DNA 信息，研究人員開發(fā)了新一代測序方法—單分子測序技術(shù),即第三代基因測序技術(shù),該技術(shù)不僅提高了讀長,而且可以直接檢測RNA 序列和甲基化序列。在此基礎(chǔ)上，第四代測序技術(shù)—單分子納米孔測序迅速成為基因測序技術(shù)的熱點(diǎn)，與前三代技術(shù)相比較,代表性的納米孔測序技術(shù)在成本和速度方面都得到大幅提升,儀器也更加小型化。盡管目前最為先進(jìn)的納米測序技術(shù)具有諸多進(jìn)步,但仍面臨很多挑戰(zhàn),且該技術(shù)目前尚處于實(shí)驗(yàn)室階段[16]。基因測序技術(shù)作為人類探索生命奧秘的重要手段之一，對生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展起到了巨大的推動作用。本研究應(yīng)用DNA一代測序技術(shù)對東北地區(qū)非綜合征型耳聾患者常見耳聾基因進(jìn)行檢測，從群體層面研究耳聾基因，繪制耳聾人群的基因突變譜，發(fā)現(xiàn)耳聾人群中的熱點(diǎn)突變，明確不同突變在人群中的貢獻(xiàn)率，并分析其發(fā)病的特點(diǎn)及規(guī)律，以了解本地區(qū)人群聾病的遺傳病因和特點(diǎn)，為東北地區(qū)的耳聾遺傳咨詢提供有益的指導(dǎo)。