農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化影響因素分析

彭亞博，田保明，崔明珠，師恭曜，李 瑞，位 芳，曹剛強

(鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450001)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化影響因素分析

彭亞博，田保明，崔明珠，師恭曜，李 瑞，位 芳，曹剛強

(鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450001)

為解決農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化效率較低的難題，以春小麥Bobwhite成熟胚為外植體，分析植物激素、愈傷組織預(yù)培養(yǎng)時間、侵染時間和共培養(yǎng)階段干燥處理對小麥成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的影響，并在遺傳轉(zhuǎn)化處理中輔以3個組織再生相關(guān)基因( TaSERK1、 TaSERK2、 TaNiR)的qRT-PCR分析。結(jié)果表明，愈傷組織預(yù)培養(yǎng)階段添加適量的2,4-D和Picloram均可誘導(dǎo)成熟胚愈傷組織的形成，但是2 mg·L-1Picloram培養(yǎng)基中愈傷組織的胚萌發(fā)率為20.78%，遠高于2,4-D誘導(dǎo)的胚萌發(fā)率(11.38%)；共培養(yǎng)階段對農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織進行干燥處理能適當(dāng)提高愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率； qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)再生相關(guān)基因 TaNiR相對表達量的增加能適當(dāng)提高愈傷組織的轉(zhuǎn)化率。

小麥；成熟胚；農(nóng)桿菌；再生；遺傳轉(zhuǎn)化

1992年Vasil等[1]以小麥幼胚的愈傷組織為外植體，利用基因槍法獲得了第一例轉(zhuǎn)基因小麥植株。隨后，國內(nèi)外小麥轉(zhuǎn)基因研究取得了很多突破性進展。Cheng等[2]首次采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因小麥，并初步建立了一套較為完整的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系。在此基礎(chǔ)上，Hu等[3]又對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素進行了系統(tǒng)研究，并將小麥的遺傳轉(zhuǎn)化效率提升至4.4%。但是由于小麥屬于典型的單子葉植物和嚴格的自花授粉植物，其細胞誘導(dǎo)高質(zhì)量愈傷組織的能力較弱。Medvecka等[4]在農(nóng)桿菌侵染Bobwhite S56品種小麥的愈傷組織中發(fā)現(xiàn)只有10.5%的高質(zhì)量愈傷組織適用于農(nóng)桿菌侵染。單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主，在受到農(nóng)桿菌侵染時不能和雙子葉植物一樣大量分泌促進農(nóng)桿菌吸附植物受傷部位的乙酰丁香酮[5]，所以在遺傳轉(zhuǎn)化過程中存在DNA導(dǎo)入頻率低等問題。因此，提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥愈傷組織的再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率是轉(zhuǎn)基因小麥研究的關(guān)鍵。

影響植物組織離體再生能力和遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素很多，如基因型、激素、培養(yǎng)環(huán)境、外植體的生理狀態(tài)等。邱肖迪等[6]研究發(fā)現(xiàn)，四倍體硬粒小麥成熟胚愈傷組織和再生能力遠高于二倍體野生一粒小麥Tb。Ding 等[7]使用Picloram(毒莠定，一種人工合成的類生長素)誘導(dǎo)小麥成熟胚的再生頻率(27.1%)高于2,4-D(12.3%)，并發(fā)現(xiàn)1 mg·L-1Picloram誘導(dǎo)的愈傷組織再生頻率最高(30.6%)，2,4-D濃度(2～4 mg·L-1)增加會導(dǎo)致愈傷組織再生頻率降低。程在全等[8]分別采用光照和暗培養(yǎng)誘導(dǎo)小麥愈傷組織，發(fā)現(xiàn)兩種處理方式雖然不會引起愈傷組織生長速率的明顯變化，但光照條件下形成的愈傷組織顏色為淺黃綠色，質(zhì)地緊密，而暗培養(yǎng)條件下的愈傷組織色澤偏白，排列疏松，兩種愈傷組織在質(zhì)量上存在一定差異。

目前報道的轉(zhuǎn)基因小麥大多是以小麥幼胚作為研究對象[9]，因為幼胚具有較強的再生能力，與其他外植體相比更容易獲得轉(zhuǎn)基因植株[10]。但是小麥幼胚同樣受到季節(jié)和發(fā)育階段等因素的限制[11]，相比之下，以小麥成熟胚為材料既能保證一定的再生能力，又具有取材方便、實驗周期較短等優(yōu)勢。因此，本實驗選用模式小麥品種Bobwhite的成熟胚為外植體，農(nóng)桿菌菌株LBA4404(含pCAMBIA3304質(zhì)粒)作為供體材料，對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的3個因素進行研究，以期為小麥成熟胚轉(zhuǎn)基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

春小麥品種Bobwhite，由江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用研究中心提供。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacience)LBA4404，攜帶Gus(β-glucuronidase)基因和Bar(biolaphos resistance)基因，并具有卡那霉素抗性(Kan+)和鏈霉素抗性(Sp+)的植物表達載體pCAMBIA3304，均由鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2P：MS培養(yǎng)基+2 mg·L-1Picloram；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2D：MS培養(yǎng)基+2 mg·L-12,4-D；根癌農(nóng)桿菌YEP液體培養(yǎng)基：10 g·L-1牛肉浸膏+10 g·L-1酵母提取液+5 g·L-1NaCl；農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)液：1/10 MS培養(yǎng)基+0.75 g·L-1MgCl2+0.02% SilwetL-77+200 μmol·L-1AS；共培養(yǎng)基：1/10 MS培養(yǎng)基+2 mg·L-1Picloram+0.75 g·L-1MgCl2+0.02% SilwetL-77+200 μmol·L-1AS；恢復(fù)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+2 mg·L-1Picloram+250 mg·L-1羧芐青霉素(cb)；篩選培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA+250 mg·L-1羧芐青霉素(cb)+10 mg·L-1草丁膦(PPT)。以上所有培養(yǎng)基pH值均為5.8，121 ℃高壓滅菌20 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方 法

1.2.1 小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)

挑選當(dāng)年收獲的籽粒飽滿、大小和色澤相對一致的Bobwhite品種小麥成熟種子，先用70%的無水乙醇消毒3 min，無菌水清洗2次，再用0.1%的升汞(HgCl2)消毒15 min，無菌水清洗3～5次后，室溫下浸泡過夜。用鑷子將成熟胚完整擠出，均勻分成4塊，分別接種于MS2D/MS2P愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，黑暗條件下25 ℃預(yù)培養(yǎng)28 d，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率、胚萌發(fā)率。本實驗無特殊說明，每組處理均為30個外植體，每組重復(fù)3次。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化

將本實驗室保存的含有pCAMBIA3304質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404接種到含有100 mg·L-1卡那霉素(k+)、100 mg·L-1鏈霉素(sp+)、100 mg·L-1利福平(Rif+)的YEP液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)至菌液OD600=1.0～2.0時，5 000 r·min-1離心8 min收集菌體，再用農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)液重懸菌體至OD600=1.0，用于轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織。首先，選取在MS2P培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一定時間(3 d、14 d和28 d)的愈傷組織浸泡在農(nóng)桿菌重懸液中，25 ℃黑暗培養(yǎng)一定時間(0.5 h、1 h、3 h、5 h)，用無菌濾紙吸干愈傷組織表面的重懸液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中或轉(zhuǎn)入鋪有干燥無菌濾紙的平皿中，25 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)3～4 d后移至恢復(fù)培養(yǎng)基中，25 ℃光照恢復(fù)培養(yǎng)5～6 d(光照時間16 h·d-1，光照強度1 500 lx)，最終在篩選培養(yǎng)基中25 ℃光照培養(yǎng)20 d左右，統(tǒng)計愈傷組織綠斑分化率。

1.2.3 組織化學(xué)染色檢測(GUS染色法)

挑選1.2.2節(jié)中共培養(yǎng)3～4 d的愈傷組織放入1.5 mL離心管中，添加適量的GUS組織化學(xué)染液，37 ℃過夜，70%乙醇脫色后肉眼觀察GUS基因表達情況，統(tǒng)計GUS瞬時表達率。

1.2.4 組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因的qRT-PCR分析

使用SuperPure Plantpoly RNA Kit(Gene Answer)試劑盒分別提取不同預(yù)培養(yǎng)時間、不同侵染時間以及共培養(yǎng)階段不同處理方式(共培養(yǎng)3～4 d)的愈傷組織總RNA，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(晶彩生物)合成cDNA，-20 ℃保存，再以cDNA為模板，2×Sybr Green qPCR Mix(Gene Answer)qRT-PCR分析組織培養(yǎng)相關(guān)再生基因的相對表達量。利用Primer 5.0設(shè)計小麥內(nèi)參基因β-actin(Accession number：KC77578.1)、小麥亞硝酸還原酶 TaNiR(Triticumaestivumnitrite reductase，Accession number：FJ527909.1)、小麥體細胞胚胎發(fā)生受體激酶1 TaSERK1(Triticumaestivumsomatic embryogenesis receptor kinase 1，Accession number：JF808017.1)和小麥體細胞胚胎發(fā)生受體激酶2 TaSERK2(Triticumaestivumsomatic embryogenesis receptor kinase 2，Accession number：JF808018.1)基因的特異擴增引物(表1)。

表1 qRT-PCR分析所用引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。GUS瞬時表達率、愈傷組織誘導(dǎo)率、胚萌發(fā)率、綠斑分化率分別用以下公式進行計算。

GUS瞬時表達率=GUS染色呈藍色的外植體數(shù)/檢測外植體總數(shù)×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；

胚萌發(fā)率=胚萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；

綠斑分化率=分化綠斑的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物激素對小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將消毒處理過的小麥成熟胚接種于MS2D/MS2P愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25 ℃黑暗條件下進行培養(yǎng)。由圖1A、1B可以觀察到預(yù)培養(yǎng)14 d時2 mg·L-12,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織呈透明的水漬狀；在添加相同濃度Picloram的培養(yǎng)基中愈傷組織表面有許多的白色根狀毛。預(yù)培養(yǎng)28 d 時，觀察到2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，表面光滑，呈乳白色；Picloram誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，表面粗糙，呈米黃色(圖1C、1D)。統(tǒng)計結(jié)果表明，Picloram和2，4-D對小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為90.26%和85.37%，差異顯著(P<0.05)；胚萌發(fā)率分別為20.78%和11.38%，差異極顯著(P<0.01)。

2.2 預(yù)培養(yǎng)時間對成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響

選取新鮮剝離的小麥成熟胚消毒處理后接種于MS2P愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，用農(nóng)桿菌重懸液分別侵染預(yù)培養(yǎng)3 d、14 d、28 d的愈傷組織，統(tǒng)計共培養(yǎng)3～4 d后的GUS瞬時表達率，以及篩選培養(yǎng)20 d的愈傷組織綠斑分化率。由圖2可以發(fā)現(xiàn)，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織GUS瞬時表達率顯著提升，綠斑分化率則緩慢降低。因此，在保證一定綠斑分化率的同時應(yīng)選擇遺傳轉(zhuǎn)化效率較高的愈傷組織(以預(yù)培養(yǎng)14 d最合適)作為轉(zhuǎn)化受體進行下一步研究。

2.3 侵染時間對成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響

將預(yù)培養(yǎng)14 d的愈傷組織農(nóng)桿菌侵染時間分別設(shè)置為0.5h、1h、3h和5h，統(tǒng)計共培養(yǎng)3～4 d后的GUS瞬時表達率以及篩選培養(yǎng)20 d的愈傷組織綠斑分化率(圖3)。結(jié)果表明，隨著農(nóng)桿菌侵染時間的延長，愈傷組織的GUS瞬時表達率迅速提升，在侵染3 h時達到最高，超過3 h則明顯下降，而整個侵染周期綠斑分化率的變化并不明顯，說明長時間的侵染并不能提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率，反而會降低愈傷組織對農(nóng)桿菌的耐受性。因此，農(nóng)桿菌侵染愈傷組織的最佳侵染時間為3 h左右。

A：2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織(14 d)；B：Picloram誘導(dǎo)的愈傷組織(14 d)；C：2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織(28 d)；D：Picloram誘導(dǎo)的愈傷組織(28 d)。

A:2,4-D induced callus(14 days) ；B:Picloram induced callus(14 days)；C:2,4-D induced callus(28 days)；D:Picloram induced callus(28 days).

圖1 不同植物激素誘導(dǎo)的愈傷組織

Fig.1 Callus induced by different plant hormones

圖2 預(yù)培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化后愈傷組織綠斑分化率及GUS瞬時表達率的影響

2.4 干燥處理對成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響

以預(yù)培養(yǎng) 3 d、14 d和28 d的小麥愈傷組織為轉(zhuǎn)化體，農(nóng)桿菌重懸液浸泡3 h后共培養(yǎng)階段分別采用兩種方式處理愈傷組織：(1)用無菌濾紙吸干愈傷組織表面的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中黑暗條件下共培養(yǎng)3～4 d；(2)用無菌濾紙吸干愈傷組織表面的培養(yǎng)液，隨后轉(zhuǎn)入鋪有干燥無菌濾紙的平皿中，黑暗條件下共培養(yǎng)3～4 d。在共培養(yǎng)階段對兩種處理方式的愈傷組織進行GUS組織化學(xué)染色鑒定，統(tǒng)計愈傷組織GUS瞬時表達率；提取相對應(yīng)的愈傷組織總RNA，用于組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因的實時熒光定量分析。篩選培養(yǎng)20 d左右，統(tǒng)計愈傷組織綠斑分化率。

圖3 侵染時間對轉(zhuǎn)化后愈傷組織綠斑分化率及GUS瞬時表達率的影響

由圖4可以發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)時間較短(3 d)的愈傷組織在共培養(yǎng)階段經(jīng)干燥處理能夠顯著提升綠斑分化率。但隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增加，未干燥處理和干燥處理的愈傷組織在綠斑分化率上并沒有太大的差異。

隨機挑取3塊轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進行追蹤GUS化學(xué)染色，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)階段未經(jīng)過干燥處理的小麥愈傷組織均未染色；而干燥處理的小麥愈傷組織中，仍有一塊可以觀察到GUS藍色斑點存在。說明共培養(yǎng)階段干燥處理的確可以適當(dāng)提高小麥愈傷組織的轉(zhuǎn)化率。

2.5 植物組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因的qRT-PCR分析結(jié)果

分別從預(yù)培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌侵染時間和共培養(yǎng)階段干燥處理3個方面進行植物組織再生相關(guān)基因( TaSERK1、 TaSERK2、 TaNiR)的qRT-PCR分析。結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)3 d的愈傷組織轉(zhuǎn)化前后3個基因的相對表達量均無明顯變化；預(yù)培養(yǎng)第14 d，轉(zhuǎn)化后的愈傷組織中僅發(fā)現(xiàn)基因 TaNiR的表達量顯著上調(diào)，提高了約1.21倍；預(yù)培養(yǎng)至28 d，轉(zhuǎn)化后的愈傷組織三個再生相關(guān)基因表達量均明顯上調(diào)(圖6)。結(jié)合圖2結(jié)果可知，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增加，GUS瞬時表達率升高，愈傷組織轉(zhuǎn)化處理前后基因 TaNiR的相對表達量也顯著提升。

以0 h為對照，侵染時間為0.5 h、1 h、3 h和5 h的愈傷組織3個基因的相對表達量均有變化(圖7)。結(jié)合圖3和圖7結(jié)果表明，農(nóng)桿菌侵染3 h的愈傷組織GUS瞬時表達率和基因 TaNiR的相對表達量均達到最大值，侵染時間超過3 h的 TaNiR基因的相對表達量和GUS瞬時表達率均大幅度下調(diào)。

圖4 干燥處理對轉(zhuǎn)化后愈傷組織綠斑分化率的影響

A：干燥處理；B：未干燥處理(箭頭指向GUS藍色斑點)。

A:Drying treatment;B:No drying treatment(Arrow points to the GUS blue spot).

圖5 轉(zhuǎn)化后的愈傷組織GUS染色

Fig.5 GUS staining of callus after the transformation

由圖8可以發(fā)現(xiàn)，與未干燥處理相比較，干燥處理預(yù)培養(yǎng)3 d的愈傷組織 TaSERK1、 TaNiR基因的相對表達量下降；預(yù)培養(yǎng)至14 d，只有 TaNiR基因相對表達量大幅度提升；預(yù)培養(yǎng)28 d的愈傷組織，3個基因相對表達量均無明顯差異。結(jié)合圖6結(jié)果表明，基因 TaNiR在農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的作用。預(yù)培養(yǎng)14 d經(jīng)干燥處理的愈傷組織GUS瞬時表達率增加伴隨著基因 TaNiR表達量的大幅度提高。

3 討 論

前人研究表明，不同種類的植物激素形成愈傷組織的質(zhì)量存在明顯的差異[12]。本研究中，雖然2,4-D和Picloram均可高頻率誘導(dǎo)小麥成熟胚愈傷組織，但2 mg·L-1Picloram誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，表面粗糙，呈米黃色，且胚萌發(fā)率遠高于2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織胚萌發(fā)率。

外植體的生理狀態(tài)對轉(zhuǎn)化頻率起著至關(guān)重要的作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)14 d的愈傷組織既能保證一定的轉(zhuǎn)化效率(GUS瞬時表達率)，又有較強的恢復(fù)再生能力(綠斑分化率)，可作為合適的轉(zhuǎn)化受體。

圖6 預(yù)培養(yǎng)時間對愈傷組織再生相關(guān)基因相對表達量的影響

0～5 h：侵染時間。

0-5 h:infection time.

圖7 侵染時間對愈傷組織再生相關(guān)基因相對表達量的影響

Fig.7 Effects of different infection time on the relative expression of callus regeneration related genes

圖8 干燥處理對愈傷組織再生相關(guān)基因相對表達量的影響

農(nóng)桿菌侵染時間是決定愈傷組織轉(zhuǎn)化率高低的主要因素之一。本試驗中，以預(yù)培養(yǎng)14 d的小麥愈傷組織為外植體，農(nóng)桿菌重懸液浸泡3 h左右的愈傷組織既不嚴重影響分化頻率，同時又能夠保證較高的轉(zhuǎn)化效率。本研究結(jié)果和前人報道的侵染時間相差很大[14]，分析其原因可能是外植體基因型的差異造成的。由于不同基因型的受體細胞對農(nóng)桿菌的敏感程度不同，受到脅迫后個體恢復(fù)能力的差異導(dǎo)致最適侵染時間不同。

郭向云等[15]將小麥幼胚形成的愈傷組織在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基前干燥處理12 h，結(jié)果顯著提高了分化頻率。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)愈傷組織發(fā)育到一定程度(預(yù)培養(yǎng)14 d)，共培養(yǎng)階段干燥處理3～4 h并不會嚴重影響愈傷組織的分化能力，反而有利于提高愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率。分析其原因可能是由于受體細胞失水，提高了滲透勢，促進了農(nóng)桿菌的吸附和T-DNA的轉(zhuǎn)移。其次，干燥處理還能抑制農(nóng)桿菌的過度生長，減少后期對愈傷組織的傷害，使受體細胞能夠更好的恢復(fù)活力，間接保證了愈傷組織的分化能力。

體細胞胚胎發(fā)生受體激酶SERKs(Somatic embryogenesis receptor kinases)是體細胞再生的標(biāo)記基因[16]，在大多數(shù)植物中均發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織的該基因表達量高于非胚性愈傷組織[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化頻率的改變并沒有引起SERK家族基因相對表達量的顯著變化。推斷SERK家族基因的表達量的改變可能與愈傷組織轉(zhuǎn)化頻率無明顯關(guān)系。NiR(Ferredoxin-nitrite reductase)作為植物硝態(tài)氮向銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵控制酶，在氮的利用及同化過程中發(fā)揮著重要作用[18]。本研究對不同因素進行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化頻率提高伴隨著 TaNiR基因相對表達量的增加。推測小麥亞硝酸還原酶 TaNiR在小麥成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用。由于小麥遺傳轉(zhuǎn)化頻率是由多基因調(diào)控的[19]，具體某個基因的變化對小麥愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響，還有待進一步深入研究。

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Factors InfluencingAgrobacteriumMediated Transformation in Mature Embryo of Wheat (Triticumastivum)

PENG Yabo,TIAN Baoming,CUI Mingzhu,SHI Gongyao, LI Rui,WEI Fang,CAO Gangqiang

(College of Life and Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450001,China)

To solve the problem ofAgrobacteriummediated transformation in mature embryo of wheat(Triticumastivum),spring wheat ‘Bobwhite’ was used as receptor.The effects of plant hormones,the pre-culture time,Agrobacteriummediated transformation time and co-culture methods on wheat mature embryo callus induction and differentiation were analysed. During the transformation,three regeneration related genes ( TaSERK1、 TaSERK2, TaNiR) were analysed by qRT-PCR. The results showed that adding 2,4-D and Picloram could induce the formation of mature embryo callus,but the germination rate of callus induced by 2 mg·L-1picloram(20.78%) is higher than that induced by 2,4-D(11.38%). Dry processing in co-culture stage could obviously improve the transformation efficiency of callus. It was found that the change of the relative expression regeneration related genes ( TaNiR) could increase the transformation rate of callus by qRT-PCR.

Wheat (Triticumastivum); Mature embryo;Agrobacterium; Regeneration; Transformation

時間：2017-04-07

2016-07-07

2016-08-25 基金項目：NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項目(U1204308)；河南省科技廳重點攻關(guān)科研項目(15210210044) 第一作者E-mail：396977982@qq.com 通訊作者：位 芳(E-mail：fangwei@zzu.edu.cn)

S512.1；S336

A

1009-1041(2017)04-0458-07

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