肺鱗狀細(xì)胞癌組織中血管擴(kuò)張刺激磷蛋白的臨床意義及生物學(xué)功能研究

許海東

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院，急診內(nèi)科，四川 成都 610072）

目前，肺癌是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]，由于其早期癥狀隱匿，手術(shù)后易復(fù)發(fā)且放化療敏感性低等生物學(xué)特點(diǎn)，肺癌已成為危害我國(guó)人民群眾身體健康的重大公共衛(wèi)生問題[2]。肺癌病理類型復(fù)雜其中以肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma, LSCC）之類型最為常見[3]，對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌分子特征的研究對(duì)于尋找新的肺癌預(yù)后靶點(diǎn)具有重要意義。

血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（vasodilator stimulated phosphoprotein, VASP）是Enabled（Ena）/VASP家族主要成員[4]，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的相關(guān)蛋白之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中VASP的表達(dá)情況與癌癥細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及患者生存獲益密切相關(guān)[6]。因而，VASP可能是一種重要的腫瘤診斷及預(yù)后分子，而VASP在肺鱗狀細(xì)胞癌中的臨床意義尚不完全清楚。

本研究探討VASP在肺鱗狀細(xì)胞癌中的臨床表達(dá)意義，以期使VASP成為肺鱗狀細(xì)胞癌診斷、治療的分子標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月-2013年1月于本院手術(shù)切除鱗狀細(xì)胞癌以及癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2 cm）50例組織標(biāo)本。其中，男性35例，女性15例；年齡45～77歲，平均（54.3±2.1）歲。

兔抗人Super Vision（SV）二步法超敏免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）試劑盒（SV0002）（購(gòu)自武漢博士德公司，內(nèi)容包括：5%牛乳清蛋白封閉液、聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG、3%過氧化氫溶液），兔抗人VASP一抗（sc-13975）及GAPDH一抗（購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司），Trizol試劑（15596026）及LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000015）、一步法RT-PCR試劑盒（10928042）（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司），VASP siRNA（5'-GGACCUACAGAGGGUGAAAdTdT-3'）、陰性對(duì)照siRNA（購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司），VASP引物（正向5'-AAAGTCAGCAAGCAGGAGGA-3'；反向5'-ATTC ATCCTTGGGGGTTTTC-3'）；GAPDH 引物（正向 5'-CG GAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'；反向5'-AGCCTT CTCCATGGTGGTGAAGAC-3'）（由上海生工生物工程公司合成），Transwell小室（#3458）（購(gòu)自美國(guó)康寧公司），Matrigel（貨號(hào)：354230）（購(gòu)自美國(guó)B&D公司）。

1.2 免疫組化檢測(cè)VASP表達(dá)

石蠟包埋的標(biāo)本組織切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟及水化預(yù)處理；用抗體稀釋液按1∶100稀釋兔抗人VASP多克隆抗體，滴加抗體于組織切片上并充分浸沒組織標(biāo)本；4℃恒溫冰箱內(nèi)孵育過夜，洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗，DAB法顯示陽(yáng)性蛋白。400倍視野下每張組織切片下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行閱片。按文獻(xiàn)[7]所述標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。最終評(píng)分≥1分者評(píng)判為VASP陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

NCI-H520細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代2～3代。按過夜增殖至愈合度達(dá)70%之密度接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×PBS溶液充分洗滌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染分組：VASP組每孔加入100 pmol VASP siRNA及5 μl轉(zhuǎn)染試劑；對(duì)照組每孔加入100 pmol的陰性對(duì)照siRNA及5 μl轉(zhuǎn)染試劑。添加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液至終體積1 ml/孔。4 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 VASP基因在腫瘤中的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)。按Trizol試劑說明書提取組織或細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增體系。設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄PCR條件：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃逆轉(zhuǎn)錄酶失活2 min，循環(huán)次數(shù)1。設(shè)置qRT-PCR條件：94℃預(yù)變性15 s；94℃變性15 s，60℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)40；最后72℃延伸10 min。通過2-△△Ct法計(jì)算VASP基因在腫瘤中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h后的NCI-H520細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度以過夜鋪滿為準(zhǔn)。無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞4 h已減弱細(xì)胞間連接。100 μl的槍頭由每孔中線劃過，PBS清洗6孔板，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)足體積至2 ml。培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)胞遷移。

1.6 Transwell侵襲小室檢測(cè)

按1∶8比例采用DMEM培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠后，每孔100 μl包被Transwell小室膜的上室面，取轉(zhuǎn)染72 h后的NCI-H520細(xì)胞，使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至5×105個(gè)/ml，上層小室每室加入250 μl細(xì)胞懸液，下層小室中加入含10% FBS的培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽擦凈上室面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下室面細(xì)胞，Giemsa染液染色。100倍光鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野計(jì)數(shù)下室面的細(xì)胞個(gè)數(shù)。以每個(gè)小室的平均細(xì)胞數(shù)為最終計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)?；颊咝g(shù)后行3年隨診訪問，Kaplan-Meier分析評(píng)價(jià)患者生存獲益，COX回歸分析判斷預(yù)后危險(xiǎn)因素，α入=0.05，α出=0.10。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VASP的表達(dá)情況

PCR結(jié)果顯示，VASP基因在肺癌組織中的表達(dá)量（1.357±0.213）高于癌旁組織（0.468±0.083），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.589，P=0.000）。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VASP主要定位于胞漿之中，呈棕黃至棕褐色顆粒狀沉積。LSCC組織中有66.0%（33/50）存在VASP陽(yáng)性表達(dá)，而癌旁組織僅38.0%（19/50例）有VASP陽(yáng)性表達(dá)，兩者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.853，P=0.005），見表1。進(jìn)一步對(duì)VASP免疫組化分進(jìn)行分析，LSCC組織中VASP的免疫組化染色平均得分為（9.341±1.252），而癌旁組織的平均得分為（3.234±0.981），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)兩者表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.318，P=0.000）。見圖1。

表1 VASP在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) 例

圖1 VASP在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

2.2 VASP表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

VASP蛋白陽(yáng)性表達(dá)的肺鱗狀細(xì)胞癌患者存在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=6.455，P=0.011）及較晚TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期，χ2=7.390，P=0.007）的情況較多見。另外，盡管其他臨床病理特征間的VASP表達(dá)也有差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 VASP的臨床病理意義分析 （n =50）

2.3 肺癌組織VASP蛋白表達(dá)與預(yù)后間的關(guān)系

隨訪完成發(fā)現(xiàn)50例患者中存活17例，死于肺癌33例，3年生存率34.00%。按VASP表達(dá)分組后發(fā)現(xiàn)，VASP陽(yáng)性組表達(dá)3年存活率為21.21%（7/33），而VASP陰性組表達(dá)則高達(dá)58.82%（10/17），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.311，P=0.004，見圖2A）。VASP陽(yáng)性表達(dá)患者的術(shù)后更易復(fù)發(fā)（χ2=9.969，P=0.002，見圖2B）。COX多元回歸分析表明，VASP陽(yáng)性表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素（b=0.818，Sb=0.326，

圖2 Kaplan-Meier生存分析曲線

2.4 沉默VASP表達(dá)對(duì)NCI-H520細(xì)胞遷移侵襲的影響

遷移及侵襲能力是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的生物學(xué)標(biāo)志。為探究VASP對(duì)肺鱗癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響，首先通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染術(shù)在NCI-H520細(xì)胞內(nèi)沉默VASP的表達(dá)（見圖3A、3B）。細(xì)胞劃痕愈合結(jié)果顯示，沉默VASP表達(dá)能抑制NCI-H520細(xì)胞遷移（31.394±4.812 vs 87.003±10.207，t=9.021，P=0.011，見圖 3C）。Transwell小室結(jié)果表明，在沉默VASP后NCI-H520細(xì)胞的侵襲能力也受到抑制（14.321±4.036 vs 5.068±2.110，t=4.609，P=0.041，見圖 3D）。

圖3 沉默VASP表達(dá)抑制肺鱗癌細(xì)胞遷移及侵襲

3 討論

肺癌是我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率占首位的胸部惡性腫瘤[8]，外科手術(shù)及術(shù)后放化療是目前肺癌的主要治療方案，但由于肺癌生物學(xué)惡性程度高，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致目前患者術(shù)后生存時(shí)間仍較短[9]。因而尋找有效的肺癌早期診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)分子標(biāo)志物十分有必要。

VASP最初是在血小板中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞骨架蛋白，其能夠與Zyxin、Vinculin及Profiilin等蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及形態(tài)改變[10]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，VASP是一種促癌分子。例如，VASP在乳腺癌組織中高表達(dá)[11]，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，人工過表達(dá)VASP能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，分子研究認(rèn)為其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT改變而實(shí)現(xiàn)的[12]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌組織中VASP呈高表達(dá)趨勢(shì)，且該類患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期的可能性更大。結(jié)合VASP作為一種細(xì)胞骨架蛋白，具有調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移的生物學(xué)功能，筆者推測(cè)，VASP高表達(dá)可能預(yù)示著腫瘤轉(zhuǎn)移的可能。因此，筆者進(jìn)一步分析入組患者術(shù)后3年內(nèi)的生存情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VASP表達(dá)陽(yáng)性患者3年總生存率僅30%左右，而3年腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)90%以上。且VASP是肺鱗癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，其表達(dá)水平對(duì)肺癌患者的預(yù)后有重要的監(jiān)測(cè)意義。通過文獻(xiàn)檢索，ZHANG等[13]在胃癌中、TU等[14]在結(jié)腸癌中的研究也得到相同結(jié)論。為進(jìn)一步明確VASP導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制是否是通過促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而實(shí)現(xiàn)，筆者通過體外小干擾RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默VASP基因的表達(dá)，通過功能學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞在下調(diào)VASP表達(dá)后遷移及侵襲能力的變化，結(jié)果顯示沉默VASP能夠降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。該現(xiàn)象從微觀生物學(xué)上驗(yàn)證VASP在肺鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)中的作用機(jī)制。

綜上所述，肺鱗癌中VASP高表達(dá)，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良臨床預(yù)后關(guān)系密切，沉默VASP表達(dá)能夠抑制體外肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，是一種潛在的肺鱗狀細(xì)胞癌診斷及治療分子指標(biāo)。