基于高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的復(fù)方菝葜體外物質(zhì)基礎(chǔ)研究

何丹 黃小龍 陳林 梁雪娟 朱立華 張水寒

摘要：目的 ?采用高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)分析復(fù)方菝葜化學(xué)成分。方法 ?色譜柱為Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水，梯度洗脫;采用電噴霧離子源在負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，通過(guò)質(zhì)譜信息、文獻(xiàn)檢索及中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）對(duì)各成分進(jìn)行解析，并進(jìn)行初步藥材歸屬。結(jié)果 ?從復(fù)方菝葜提取物中共解析出29個(gè)成分，主要包括酚酸類、黃酮類、脂肪酸類、三萜類、香豆素類等成分，部分化合物獲得初步藥材歸屬。結(jié)論 ?采用HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)能準(zhǔn)確、高效鑒定復(fù)方菝葜各組成成分，為其藥效學(xué)研究及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：復(fù)方菝葜;高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜;酚酸;黃酮

中圖分類號(hào)：R284.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）11-0068-06

Abstract： Objective To analyze the chemical compositions of compound Smilacis Chinae Rhizoma through high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry （HPLC-Q-TOF-MS）. Methods HPLC used ultimate AQ-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）; detection wavelength was 280 nm; gradient elution with methanol-water （containing 0.1% formic acid） as mobile phase and flow rate of 0.6 mL/min; column temperature was 25 ℃; the injection volume was 5 μL. Data was acquired in negative ion mode using ESI. Each composition was analyzed by mass spectrometry information， literature search， and TCM System Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）. Preliminary attribution of Chinese materia medica was conducted. Results A total of 29 compositions were analyzed from the compound Smilacis Chinae Rhizoma， including phenolic acids， flavonoids， fatty acids， triterpenoids， coumarins， etc.， and each composition has preliminary attribution of Chinese materia medica. Conclusion HPLC-Q-TOF-MS technology can be used to identify the compositions of compound Smilacis Chinae Rhizoma， which provides references for its pharmacodynamic study and quality control.

Keywords： compound Smilacis Chinae Rhizoma; high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry; phenolic acids; flavonoids

復(fù)方菝葜顆粒（國(guó)藥準(zhǔn)字B20020355）由菝葜、魚腥草、貓爪草、款冬花、枸杞子、大棗（去核）、土鱉蟲、鮮鱧魚組成，具有清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、滋陰益氣功效，可用于改善肺癌、子宮頸癌伴有咳嗽、胸痛、帶下異常等癥狀，是治療肺癌的復(fù)方制劑。復(fù)方菝葜顆粒配合放療、化療或手術(shù)等治療癌癥，可緩解患者痛苦，起到增效減毒的作用;對(duì)于晚期失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者，可明顯改善臨床癥狀，提高患者生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期[1]。

高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)作為一種體外物質(zhì)基礎(chǔ)研究手段，具有分辨率高、效率高、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，較傳統(tǒng)分離分析技術(shù)可明顯縮短分析周期，尤其適用于復(fù)雜組分的成分分析，全面闡明中藥組成，有利于整體把握復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)，目前已廣泛應(yīng)用于中藥及復(fù)方制劑成分分析[2-3]。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/ LSP/tcmsphp）以《中華人民共和國(guó)藥典》為核心，整合了499種中草藥，收納29 000余種化學(xué)成分，可用于中藥及復(fù)雜成分的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)[4]。

本研究利用HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)復(fù)方菝葜的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)分析，聯(lián)合文獻(xiàn)調(diào)研和TCMSP對(duì)各成分進(jìn)行初步歸屬和類別歸納，為復(fù)方菝葜顆粒的藥效學(xué)研究和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 ?儀器與試藥

安捷倫1290 Infinity型高效液相色譜系統(tǒng)（配有四元泵及在線脫氣、紫外檢測(cè)器、6530 Q-TOF質(zhì)譜儀），安捷倫科技公司;AL204型十萬(wàn)分之一電子分析天平，梅特勒-托利多公司;KM-500DB型超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司。

試驗(yàn)樣品均購(gòu)自湖南永康堂大藥房連鎖有限公司，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所劉浩助理研究員鑒定，菝葜（批號(hào)2017110101）為百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根莖，魚腥草（批號(hào)18110501）為二白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分，貓爪草（批號(hào)18053002）為毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根，枸杞子（批號(hào)18120902）為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarm L.的干燥成熟果實(shí)，大棗（批號(hào)20180101）為鼠李科植物棗Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果實(shí)，款冬花（批號(hào)180901）為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，土鱉蟲（批號(hào)20161006）為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鱉Steleophaga plancyi（Boleny）的雌蟲干燥體。

落新婦苷對(duì)照品（批號(hào)1DBG-QHTR，HPLC純度≥98%），中國(guó)食品藥品檢定研究院;金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)CHB160904，HPLC純度≥98%）、3，5-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品（批號(hào)CHB171013，HPLC純度≥98%）、3，4-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品（批號(hào)CHB160725，HPLC純度≥98%）、4，5-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品（批號(hào)CHB160726，HPLC純度≥98%），成都克洛瑪生物科技有限公司。甲酸和甲醇均為色譜純，美國(guó)TEDIA公司;其余試劑均為分析純;水為純凈水，華潤(rùn)怡寶飲料（長(zhǎng)沙）有限公司。

2 ?方法

2.1 ?樣品制備

精密稱取菝葜、魚腥草、貓爪草、枸杞子、大棗（去核）各150 g，款冬花、土鱉蟲各50 g，鮮鱧魚90 g。第1次加3760 mL水，煎煮1.5 h，第2次加2820 mL水，煎煮1 h，合并煎液，濃縮，冷凍干燥儀干燥，得浸膏，備用。取5 g復(fù)方菝葜浸膏，溶于20 mL水分散，石油醚（每次40 mL）萃取至下層無(wú)色，下層繼續(xù)用乙酸乙酯（每次40 mL）萃取4～5次，合并上層溶液，濃縮，蒸干，用甲醇復(fù)溶至10 mL。

2.2 ?色譜條件

色譜柱為Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～20%A;10～17 min，20%～25%A;17～19 min，25%～25%A;19～21 min，25%～28%A;21～35 min，28%～30%A;35～42 min，30%～36%A;42～50 min，36%～39%A;50～70 min，39%～44%A;70～80 min，44%～95%A;80～90 min，95%～95%A）。

2.3 ?質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式掃描，毛細(xì)管電壓4 000 V，離子源溫度350 ℃，霧化器壓力276 kPa，干燥器體積流量6 L/min，錐孔65 V，干燥器溫度350 ℃，碎片電壓135 V，質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z 100～1000，采樣頻數(shù)0.1 s、間隔0.02 s，碰撞能量分別采用10、15 eV。測(cè)量樣品前使用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，以降低質(zhì)量精準(zhǔn)度誤差。

3 ?結(jié)果

從復(fù)方菝葜提取物中共獲得29個(gè)化合物，分別為：6個(gè)脂肪酸類、11個(gè)酚酸類、7個(gè)黃酮類、2個(gè)三萜類、1個(gè)香豆素類?；鍒D見圖1。將保留時(shí)間（tR）、質(zhì)譜信息結(jié)合對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)及TCMSP數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)成分指認(rèn)和初步藥材歸屬，結(jié)果見表1。

3.1 ?脂肪酸類

共鑒定6個(gè)已知的脂肪酸，負(fù)離子模式下產(chǎn)生[M-H]-的分子離子峰具體為：琥珀酸（峰1）m/z 117.018 5，壬二酸（峰18）m/z 187.096 8，棕櫚酸（峰28）m/z 255.232 8，亞油酸（峰24）m/z 20.217 3，亞麻酸（峰25）m/z 279.232 6，11-十八碳烯酸（峰29）m/z 281.248 1。前3個(gè)成分為飽和脂肪酸，后3個(gè)成分為不飽和脂肪酸。這些通常以羧基部分失去H2O和CO2形成的碎片離子為主，其中多不飽和脂肪酸及一些單不飽和脂肪酸的質(zhì)譜特征還在于出現(xiàn)一系列以14 m/z為基本單位分開的離子峰，可通過(guò)切割脂肪酸鏈中的連續(xù)C-C單鍵定位不飽和脂肪酸雙鍵的位置。故峰24、25、29還分別出現(xiàn)了m/z 209[M-H-C5H10]-、m/z 249[M-H-C2H4]-、m/z 197[M-H-C6H12]-用作分子中存在雙鍵的指示劑，裂解途徑與文獻(xiàn)報(bào)道[5]一致。以11-十八碳烯酸為例，其碎片離子及結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 ?11-十八碳烯酸二級(jí)碎片離子圖

3.2 ?酚酸類

峰3、4、5的tR分別為12.084、14.453、16.905 min，負(fù)離子模式下生成的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 167.033 8、m/z 153.018 6和m/z 137.023 5;均檢測(cè)到失去CO2的特征碎片離子[M-H-CO2]-，分別為m/z 123、m/z 109、m/z 93，根據(jù)元素組成分析，三者對(duì)應(yīng)的分子式分別為C8H8O4、C7H6O4、C7H6O3，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為168、155和138，推測(cè)峰3、4、5可能分別為香草酸、原兒茶酸和對(duì)羥基苯甲酸，對(duì)羥基苯甲酸的碎片離子及結(jié)構(gòu)見圖3。峰7在峰5基礎(chǔ)上還檢測(cè)到m/z 137[M-H-CH3]-的碎片離子，根據(jù)其元素組成分析，該化合物分子式為C8H803，推測(cè)該成分為對(duì)羥基苯甲酸甲酯。峰11、12的tR分別為20.692、34.039 min，峰11的質(zhì)譜信息檢測(cè)到離子對(duì)m/z 179.034 6[M-H]-和m/z135[M-H-CO2]-，峰12號(hào)的質(zhì)譜信息檢測(cè)到離子對(duì)m/z 163.039 3[M-H]-和m/z 119[M-H-CO2]-，根據(jù)二者元素組成為C9H8O4、C9H8O3，分別推測(cè)為咖啡酸和對(duì)香豆酸。以上質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]一致。