ＧＣ法測(cè)定維Ｅ三油膠丸中α－亞麻酸和γ－亞麻酸的含量

黃春青 曹桂紅 祝晶

【摘 要】 目的：建立維E三油膠丸中α-亞麻酸和γ-亞麻酸含量測(cè)定方法。方法：采用氣相色譜法，色譜柱為DB-WΑX（30m×0.32mm×0.25μm）毛細(xì)管柱;柱溫210℃;FID檢測(cè)器;進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度為250℃;進(jìn)樣量1μL;分流比為10∶ 1。結(jié)果：α-亞麻酸甲酯在0.308 0～7.699 mg/mL-1范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r=1），γ-亞麻酸甲酯在0.049 71～1.243 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r=1）;α-亞麻酸回收率為99.44%（n=9，RSD=1.9%），γ-亞麻酸回收率為99.14%（n=9，RSD=2.0%）。結(jié)論：建立的方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠，可用于維E三油膠丸中α-亞麻酸和γ-亞麻酸的定量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 ?維E三油膠丸;α-亞麻酸;γ-亞麻酸;含量;GC

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1 ??【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ???【文章編號(hào)】1007-8517（2019）18-0041-05

Abstract：Objective To establish a method to determine the α-Linolenic acid and γ-Linolenic acid in Vitmain E and Three Oils Soft Capsules.Method GC method was used， column was DB-WΑX（30m×0.32mm×0.25μm），column temperature 210℃; FID detector; inlet temperature and detector temperature 250 ℃; volume of injection was 1 μL; and the shunt ratio 10∶ 1. Results Good linearity was shown for α-Linolenic acid in the concentration range of 0.308 0～7.699 mg/mL（R=1）， Good linearity was shown for γ-Linolenic acid in the concentration range of 0.049 71～1.243 mg/mL（R=1）， α-Linolenic acid recovery rate was 99.44%（n=9，RSD=1.9%），γ-Linoleniccacid recovery rate was 99.14%（n=9，RSD=2.0%）.Conclusion The method is simple， rapid， accurate， and can be used for Determination of α-Linolenic acid and γ-Linolenic acid in Vitmain E and Three Oils Soft Capsules.

Keywords：Vitmain E and Three Oils Soft Capsules;α-Linolenic acid;γ-Linolenic acid;DHA-E;content;GC

維E三油膠丸是貴州神奇藥業(yè)有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的品種，曾用名為心腦三效膠丸，處方由維生素E、精魚(yú)油、月見(jiàn)草油和蘇子油組成，主要用于高脂血癥。維E三油膠丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)處方中的維生素E進(jìn)行了質(zhì)量控制，而未對(duì)處方中其他三種成分進(jìn)行質(zhì)量控制。為確保藥品質(zhì)量，保障用藥安全，研究對(duì)處方中的精魚(yú)油、月見(jiàn)草油和蘇子油均進(jìn)行了相應(yīng)的質(zhì)量控制。蘇子油的主要有效成分為α-亞麻酸，具有降脂、降壓、降糖、抑制出血性腦疾病和血栓性疾病、增強(qiáng)智力、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)視力、預(yù)防過(guò)敏性疾病、預(yù)防炎癥以及減緩人體衰老等功能[1-5]。月見(jiàn)草油的主要有效成分為γ-亞麻酸，具有抗炎、抗脂質(zhì)氧化、抗血栓、降脂、降糖等作用，已應(yīng)用于多種臨床疾病[6-10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津GC-2014氣相色譜儀（FID檢測(cè)器）;島津GC-2010plus氣相色譜儀（FID檢測(cè)器）;METTLER TOLEDO XS205電子天平;METTLER TOLEDO XPE206DR電子天平;PEG-20M（30 m×0.32mm×0.25μm）毛細(xì)管柱;DB-WAX（30 m×0.32mm×0.25μm） 毛細(xì)管柱;PEG-20M（30 m×0.25mm×0.25μm） 毛細(xì)管柱。

1.2 試劑與試藥 α-亞麻酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)：111624-201705）、γ-亞麻酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)：110898-201605）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，二十一烷酸甲酯（批號(hào)：M2260010，ANPLE Laboratory Technologies（shanghai）Inc）;正二十四烷（批號(hào)：122365，Dr.Ehrenstorfer GmbH）;十七烷酸甲酯（批號(hào)：T2370005，ANPLE Laboratory Technologies（shanghai）Inc）;正十九烷（批號(hào)：115410，Dr.Ehrenstorfer GmbH）;其余試劑為分析純，市售;維E三油膠丸（批號(hào)：S20171001、S20171002、S20171003、S20171004、S20171005、S20171006、S20171007、S20171008、S20171009、S20171010）均由貴州神奇制藥有限公司提供。方法學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品批號(hào)為S20171010。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及測(cè)定法

2.1.1 色譜條件 采用DB-WΑX（30m×0.32mm×0.25μm）毛細(xì)管柱;柱溫210℃;FID檢測(cè)器;進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度為250℃;進(jìn)樣量1μL;分流比為10∶ 1。二十一烷酸甲酯峰、α-亞麻酸甲酯峰和γ-亞麻酸甲酯峰分別與相鄰峰之間的分離度均應(yīng)符合要求。

2.1.2 測(cè)定法 精密稱(chēng)取二十一烷酸甲酯適量，加正庚烷配制成每1 mL約含2.5 mg 的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液;精密稱(chēng)取α-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯對(duì)照品適量，加正庚烷配制成每1 mL約含α-亞麻酸甲酯15 mg 和γ-亞麻酸甲酯2.5 mg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液（1），精密量取對(duì)照品溶液（1）和內(nèi)標(biāo)溶液各2 mL置10 mL量瓶中，加正庚烷定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液;取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞試管中，加入0.5 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，密塞，置60℃水浴中皂化15min，待油珠完全溶解，放冷，加15%三氟化硼甲醇溶液2 mL，振搖，密塞，置60℃水浴中酯化2 min，放冷，精密加入正庚烷8 mL，振搖，加飽和氯化鈉溶液2 mL，振搖，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，振搖，靜置，取上層液作為供試品溶液。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1∶ l，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算供試品中α-亞麻酸和γ-亞麻酸的含量，結(jié)果乘以0.952，即得。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱(chēng)取二十一烷酸甲酯0.256 4 g置100 mL量瓶中，加正庚烷溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取α-亞麻酸甲酯對(duì)照品0.308 0 g和γ-亞麻酸甲酯對(duì)照品0.049 76 g置同一20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 采用廠(chǎng)家提供的缺月見(jiàn)草油陰性樣品和缺蘇子油陰性樣品，按“2.1”條項(xiàng)下色譜條件及樣品測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陰性樣品均無(wú)干擾。供試品中α-亞麻酸甲酯峰、γ-亞麻酸甲酯峰和二十一烷酸甲酯峰的保留時(shí)間，與對(duì)照溶液中的保留時(shí)間一致，各測(cè)定峰峰型良好，與相鄰峰分離度達(dá)到要求。

2.4 線(xiàn)性考察 精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0和5 mL分別置10 mL量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，加正庚烷定容至刻度，作為線(xiàn)性1到6溶液。分別吸取上述線(xiàn)性1到6溶液各 1（l注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖。以α-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯對(duì)照品的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，α-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得α-亞麻酸甲酯回歸方程：Y=1.837 6X-0.000 6（r =1.000），表明α-亞麻酸甲酯在0.308 0～7.699 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系;γ-亞麻酸甲酯回歸方程：Y=1.824 8X+0.001 7（r =1.000），表明γ-亞麻酸甲酯在0.049 71～1.243 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1”條項(xiàng)下制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，室溫下分別在0、2、4、6、8和12 h精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1（l注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液中α-亞麻酸甲酯與內(nèi)標(biāo)比值RSD分別為0.65%和0.90%，γ-亞麻酸甲酯與內(nèi)標(biāo)比值RSD分別為0.34%和0.28%。表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1”條項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，同時(shí)制備對(duì)照品溶液，精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1∶ l注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果α-亞麻酸含量為140.933 6 mg/g，RSD為0.68%;γ-亞麻酸含量為23.571 7 mg/g，RSD為0.73%。

2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取γ-亞麻酸甲酯對(duì)照品0.050 11 g，置20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液（1）;精密稱(chēng)取α-亞麻酸甲酯對(duì)照品0.290 7 g，置20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液（2）。精密稱(chēng)取二十一烷酸甲酯0.063 00 g置25 mL量瓶中，加正庚烷溶解稀釋至刻度，搖勻，即得內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱(chēng)取樣品約0.08 g、0.10 g和0.12 g，置50 mL具塞試管中，按“2.1”條下測(cè)定法同法操作至置60℃水浴中酯化2 min，放冷，各精密加入對(duì)照品貯備液（1）和對(duì)照品貯備液（2）0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL，再分別精密加入正庚烷6.4 mL、6.0 mL和5.6 mL，振搖，加飽和氯化鈉溶液2 mL，振搖，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，振搖，靜置，取上層液，即得。高、中、低3個(gè)濃度樣品，各平行制備3份，共9份。結(jié)果α -亞麻酸回收率為99.44%（n=9，RSD=1.9%），γ-亞麻酸回收率為99.14%（n=9，RSD=2.0%）。

2.8 耐用性試驗(yàn) 按“2.1”條項(xiàng)下測(cè)定法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1 μL注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量。比較了不同色譜柱、不同進(jìn)樣口溫度、不同檢測(cè)器溫度、不同柱溫和不同儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，各條件下，各色譜峰峰型良好，與相鄰峰分離度均達(dá)到要求。結(jié)果表明該方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果良好。

2.9 檢出限和定量限的測(cè)定 按 “2.1”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，并稀釋制成不同濃度的對(duì)照品溶液，精密量取各1∶ 1注入氣相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)條項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，以信噪比S/N≈10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限、S/N≈3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限。測(cè)得α-亞麻酸和γ-亞麻酸的檢出限約為29.3 ng和23.66 ng;測(cè)得α-亞麻酸和γ-亞麻酸的定量限約為146.6 ng和70.99 ng。

2.10 樣品含量測(cè)定 按“2.1”條項(xiàng)下測(cè)定法制備10批次樣品的供試品溶液，同時(shí)制備對(duì)照品溶液，精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1∶ 1注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果如下。

3 討論

3.1 樣品制備過(guò)程的優(yōu)選 經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，要測(cè)定樣品中α-亞麻酸和γ-亞麻酸的含量，需要對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化后進(jìn)行測(cè)定。目前甲酯化的方法主要有三氟化硼-甲醇法、酸催化法、快速甲酯化法等[6-7]。通過(guò)前期的大量實(shí)驗(yàn)，選擇三氟化硼-甲醇法，該法由于其先用堿中和了非中性的游離脂肪酸，又用三氟化硼作酸性催化劑，在一定的溫度下，加速了甲醇和油脂之間進(jìn)行的醇解反應(yīng)，使油脂的甲酯化既快又完全試驗(yàn)中加入飽和氯化鈉可加大溶液中離子的強(qiáng)度，有利于脂肪酸甲酯被充分提取出[11-12]。影響提取α-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯的主要因素有溶劑、皂化及甲酯化試劑加入量、是否充氮保護(hù)等。同時(shí)，內(nèi)標(biāo)物也是在樣品制備過(guò)程中加入，因此同時(shí)考察加入不同內(nèi)標(biāo)物對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。選取U4（44）表，考察因素及水平見(jiàn)表2，按表3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以 α-亞麻酸含量（Y1），γ-亞麻酸含量（Y2），α-亞麻酸甲酯峰峰型和分離度（Y3），γ-亞麻酸甲酯峰峰型和分離度（Y4），內(nèi)標(biāo)物峰型及分離度（Y5）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，所得最佳樣品制備工藝結(jié)果較滿(mǎn)意，重現(xiàn)性良好且易于操作，反映了本研究的設(shè)計(jì)方法和技術(shù)路線(xiàn)是科學(xué)、合理、必要和可行的。

3.2 限度范圍 月見(jiàn)草油的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為WS-10001-（-HD-0598）-2002，規(guī)定含γ-亞麻酸不得少于7.5%（g/g）。蘇子油目前無(wú)藥品標(biāo)準(zhǔn)，查詢(xún)到中華人民共和國(guó)糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LS/T3254-2017含α-亞麻酸為56.0%～70.0%。根據(jù)維E三油膠丸的處方，500g維E三油膠丸內(nèi)容物含月見(jiàn)草油125 g，含蘇子油125 g，折算維E三油膠丸中含α-亞麻酸與γ-亞麻酸應(yīng)不少于140.0 mg/g和18.75 mg/g，考慮制劑制備過(guò)程的損耗及樣品有效期，擬定維E三油膠丸中含α-亞麻酸與γ-亞麻酸應(yīng)不少于126.0 mg/g和17.0 mg/g。從10批樣品的測(cè)定結(jié)果可以看出，10批次樣品含α-亞麻酸和γ-亞麻酸含量均大于限度，說(shuō)明廠(chǎng)家對(duì)月見(jiàn)草油和蘇子油的質(zhì)量控制較好。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，可以看出，該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于測(cè)定維E三油膠丸中蘇子油和月見(jiàn)草油的主要活性成分α-亞麻酸和γ-亞麻酸的含量。

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（收稿日期：2019-07-05 編輯：劉斌）