芪蛭膠囊對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠豆蔻?；鞍准っ窩表達(dá)的影響

張婷婷 滕堯 陸雪健 王東巖 蔣希成

摘要：目的 ?觀察芪蛭膠囊對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠PKC-MARCKS信號(hào)通路豆蔻?；鞍准っ窩（MARCKS）表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 ?采用線栓法制作SD大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血再灌注模型，缺血2 h后行再灌注。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥組和陽性藥組，各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，連續(xù)8 d，第8日給藥1 h后造模，除假手術(shù)組外，其余3組分為4個(gè)亞組，即再灌注后6、24、72 h和7 d組。應(yīng)用Zea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，之后取大鼠腦組織缺血部分，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，Western blot檢測(cè)MARCKS及p-MARCKS蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)MARCKS mRNA的表達(dá)。結(jié)果 ?模型組大鼠神經(jīng)功能較假手術(shù)組損傷明顯（P<0.05），中藥組和陽性藥組大鼠腦組織再灌注后72 h神經(jīng)功能評(píng)分較模型組明顯降低（P<0.05）;HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞無明顯變化，模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞受損嚴(yán)重，中藥組和陽性藥組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷程度較模型組輕;Western blot和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組較假手術(shù)組大鼠腦組織MARCKS蛋白和mRNA及p-MARCKS蛋白均呈高表達(dá)（P<0.05），陽性藥組和中藥組大鼠腦組織MARCKS蛋白、mRNA及p-MARCKS蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 ?芪蛭膠囊可下調(diào)模型大鼠腦組織MARCKS蛋白及mRNA的高表達(dá)，進(jìn)而緩解腦缺血再灌注損傷。

關(guān)鍵詞：缺血性中風(fēng);腦缺血再灌注;芪蛭膠囊;豆蔻?；鞍准っ窩;大鼠

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）11-0040-06

Abstract： Objective To observe the effects of Qizhi Capsules on the expression of MARCKS PKC-MARCKS signaling pathway in ischemic stroke rats. Methods The cerebral ischemia-reperfusion model of middle cerebral artery occlusion in SD rats was made by suture method. Reperfusion was performed 2 hours after ischemia. SD rats were randomly divided into four groups： sham-operation group， model group， TCM group and positive medicine group， and each medication group was administered continuously for 8 days. The model was made 1h after administration on the 8th day， the other three groups except for the sham-operation group were divided into 4 subgroups， namely reperfusion 6 h， 24 h， 72 h， and 7 d groups. Neurological deficit scores in rats were evaluated using Zea Longa 5-point scale. The ischemic part of rat brain was taken out. The morphology of the cells was observed by HE staining. The expression of MARCKS and p-MARCKS protein was detected by Western blot. The expression of MARCKS mRNA was detected by RT-PCR. Results The nerve function damage in model group was more serious than that in sham-operation group （P<0.05）. The nerve function score in positive medicine group and TCM group at reperfusion 72 h was significantly lower than that in model group （P<0.05）. The results of HE staining showed thatthe nerve cells in the sham-operation group had no obvious changes， and the nerve cells in the model group were seriously damaged. The damage degree of TCM group and positive medicine group was lighter than that of the model group; Western blot and RT-PCR showed that the MARCKS protein and mRNA and p-MARCKS protein in the model group were over-expressed （P<0.05）. Both the positive medicine group and TCM group could down-regulate the expressions of MARCKS protein and mRNA and p-MARCKS protein （P<0.05）. Conclusion Qizhi Capsules can down-regulate ischemic stroke rats the overexpression of MARCKS protein and mRNA， and then alleviate the cerebral ischemia-reperfusion injury.

Keywords： ischemic stroke; cerebral ischemia-reperfusion; Qizhi Capsules; MARCKS; rats

缺血性中風(fēng)是常見的危害人類神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，占腦中風(fēng)比例較大。PKC-MARCKS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)腦缺血后被激活，豆蔻?；鞍准っ窩（MARCKS）在神經(jīng)功能和神經(jīng)疾病中扮演重要的角色[1]，其為蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的特異性底物蛋白[2]。MARCKS能調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)元軸突生長、內(nèi)吞和胞吐及突觸可塑性等基本過程，揭示MARCKS蛋白在一系列生理過程是一個(gè)不可或缺的參與者，參與了大腦皮層的發(fā)育與衰老相關(guān)的認(rèn)知能力下降等過程。目前，已知的關(guān)于MARCKS的調(diào)節(jié)機(jī)制均與PKC磷酸化有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芪蛭膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血具有保護(hù)作用[3]，但其具體分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血再灌注模型，觀察芪蛭膠囊對(duì)模型大鼠缺血區(qū)腦組織形態(tài)及MARCKS、p-MARCKS表達(dá)的影響，探討芪蛭膠囊對(duì)缺血性中風(fēng)模型大鼠的作用機(jī)制。

1 ?材料和方法

1.1 ?動(dòng)物

健康雄性SD大鼠80只，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYSK（黑）2013-012。飼養(yǎng)于溫度（20±2）℃、相對(duì)濕度40%～42%環(huán)境，12 h光照，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物

芪蛭膠囊（黃芪30 g、丹參20 g、水蛭15 g、地龍15 g等），黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，批號(hào)170301;尼莫地平片，哈藥集團(tuán)三精明水藥業(yè)有限公司，批號(hào)20180524。

1.3 ?主要試劑與儀器

兔抗MARCKS（20661-1-Ap，Proteintech），兔抗p-MARCKS（11992，CST），山羊抗兔IgG（H+L）HRP（天德悅S004），山羊抗小鼠IgG（H+L）HRP（天德悅S001），GAPDH鼠單抗（天德悅TDY042），超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581），HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co. Ltd，Cat#CW0744）。渦旋振蕩儀（其林貝爾QL-902），離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5415D），分光光度計(jì)（Therno Scientific，NANODROP 2000），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，ABI7500），F(xiàn)resco低溫冷凍離心機(jī)（Thermo），MultiSkan3酶標(biāo)儀（Thermo），Mini P-4電泳槽（Cavoy）。

1.4 ?分組及給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥組和中藥組，其中假手術(shù)組6只，其余3組各24只。根據(jù)人與動(dòng)物給藥劑量比例換算，大鼠用藥劑量=人用藥劑量×0.018÷200 g。中藥組給予芪蛭膠囊（2.6 mg/mL）藥液灌胃，陽性藥組給予尼莫地平（3 mg/mL）藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)8 d。模型組、中藥組和陽性藥組根據(jù)缺血2 h再灌注后時(shí)間不同隨機(jī)分為再灌注后6、24、72 h和7 d共4個(gè)亞組。

1.5 ?造模

第8日給藥1 h后開始造模。采用Zea Longa線栓法[4]制作大鼠腦缺血損傷動(dòng)物模型，即大腦中動(dòng)脈阻塞模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（35 mg/kg）麻醉，仰臥位固定，于頸部正中線處做一縱切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。然后在近心端結(jié)扎CCA、ECA，用小動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA遠(yuǎn)心端近分叉部，然后在CCA近心端距分叉部4 mm剪一小口，將栓線插入到CCA，輕推栓線達(dá)分叉處，松開小動(dòng)脈夾，從血管分叉處進(jìn)入ICA，從分叉處插入深度約18 mm，于CCA遠(yuǎn)心端用細(xì)線結(jié)扎，消毒后縫合傷口。術(shù)后2 h將栓線拔出約1 cm，行再灌注。假手術(shù)組大鼠不插入栓線，其余步驟同其他組。

1.6 ?神經(jīng)功能缺損評(píng)分

參照Zea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)成模大鼠進(jìn)行初選：無神經(jīng)缺損癥狀，0分;不能充分伸展左側(cè)前肢，1分;行走時(shí)身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分;行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒，3分;不能自發(fā)行走，意識(shí)水平喪失，4分。選取1～3分者，將不合格大鼠剔除，通過隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物數(shù)并重新造模。

1.7 ?標(biāo)本處理

所有實(shí)驗(yàn)組各取2只大鼠行腦組織HE染色，腦組織標(biāo)本制作經(jīng)心臟灌流。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（35 mg/kg）麻醉，先灌注生理鹽水約100 mL，再灌注4%多聚甲醛緩沖液。灌注固定完成后，迅速剪取大鼠頭部，用彎鉗小心將缺腦組織剝離，切取2 mm2缺血區(qū)腦組織，4%多聚甲醛緩沖液4 ℃固定24 h，組織脫水、透明及浸蠟，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色。各組余下4只大鼠，其中2只用于大鼠腦組織Western blot檢測(cè)，另外2只用于大鼠腦組織RT-PCR檢測(cè)。模型大鼠麻醉后冰上斷頭取腦組織，剝離腦組織至冰上，刀片切取缺血區(qū)腦組織，置于凍存管中液氮保存，提取總蛋白及總RNA備用。

1.8 ?Western blot檢測(cè)豆蔻?；鞍准っ窩及其磷酸化蛋白表達(dá)

將缺血區(qū)腦組織剪碎，提取總蛋白。加裂解液，腦組織15 000 r/min勻漿10 s，冰上孵育20 min，4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液，應(yīng)用BCA法蛋白定量，酶標(biāo)儀讀取OD值，分裝后置于-80 ℃冰箱保存。以RIPA調(diào)整蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5%，20 μg/孔上樣，通過預(yù)染蛋白Marker確定電泳停止時(shí)間，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)模和染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。用3%BSA-TBST稀釋MARCKS、p-MARCKS蛋白，濃度分別為1∶4000和1∶500，室溫孵育10 min，4 ℃過夜。第2日膜處理后曝光，顯影2 min，定影。拍照保存圖像，分析軟件測(cè)定條帶光密度值，以光密度值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 ?RT-PCR檢測(cè)豆蔻?；鞍准っ窩 mRNA表達(dá)

用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。取5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)RNA的完整性。設(shè)計(jì)引物MARCKS mRNA，用GAPDH作內(nèi)參。引物設(shè)計(jì)見表1。用UltraSYBR Mixture（With ROX）進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增步驟：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共45個(gè)循環(huán)。取5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。選取樣本cDNA進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2 μL作為模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)60～95 ℃進(jìn)行融解曲線分析，儀器自動(dòng)繪制出對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)RT-PCR原始檢測(cè)結(jié)果，用2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.10 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ±s表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?芪蛭膠囊對(duì)模型大鼠腦組織神經(jīng)功能評(píng)分的影響

除假手術(shù)組外，其余大鼠自缺血再灌注后6 h起即有明顯的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，多數(shù)大鼠出現(xiàn)患側(cè)肢體屈曲內(nèi)收、雙側(cè)伸出不對(duì)稱的癥狀，缺損癥狀明顯者多出現(xiàn)行走時(shí)向患側(cè)轉(zhuǎn)圈，癥狀越重則旋轉(zhuǎn)直徑越小，可出現(xiàn)行走時(shí)追尾。模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)整體水平呈下降趨勢(shì)，中藥組、陽性藥組較模型組整體評(píng)分降低，再灌注后72 h中藥組和陽性藥組較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），再灌注后7 d中藥組較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表2。

2.2 ?芪蛭膠囊對(duì)模型大鼠腦組織形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞密集，排列整齊，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)呈粉紅色，胞核居中，核仁清晰，周圍間隙無水腫;模型組再灌注后72 h大鼠缺血區(qū)可見神經(jīng)元細(xì)胞核染色加深，神經(jīng)元胞漿腫脹甚至破裂，細(xì)胞周圍出現(xiàn)間隙，小膠質(zhì)細(xì)胞開始出現(xiàn)，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，血管周圍間隙擴(kuò)大，可見大量紫色深染的凋亡小體，炎性細(xì)胞及膠質(zhì)浸潤，增生明顯;陽性藥組大鼠較模型組神經(jīng)元水腫有所減輕，細(xì)胞周圍間隙有所減輕，網(wǎng)格排列情況較輕，可見少量紫色深染的凋亡小體;中藥組大鼠較模型組神經(jīng)元水腫減輕，細(xì)胞周圍間隙減小，未見網(wǎng)格排列情況，未發(fā)現(xiàn)大空泡;中藥組和陽性藥組大鼠再灌注后72 h較模型組形態(tài)差異最明顯，神經(jīng)元損傷減少，神經(jīng)元數(shù)量增加，神經(jīng)元腫脹明顯減輕，可見少量紫色深染的凋亡小體。見圖1。

2.3 ?芪蛭膠囊對(duì)模型大鼠腦組織豆蔻酰化蛋白激酶C及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響

模型組大鼠腦組織MARCKS、p-MARCKS蛋白呈高表達(dá)，假手術(shù)組呈低表達(dá)，中藥組和陽性藥組大鼠表達(dá)量低于模型組。再灌注后各時(shí)間點(diǎn)各亞組顯示，與模型組比較，中藥組和陽性藥組大鼠腦組織蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖2、圖3、表3和表4。

2.4 ?芪蛭膠囊對(duì)模型大鼠腦組織MARCKS mRNA表達(dá)的影響

目標(biāo)基因與GADPH比值顯示，模型組大鼠腦組織MARCKS mRNA呈高表達(dá)，假手術(shù)組大鼠腦組織呈低表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。再灌注后各時(shí)間點(diǎn)各亞組顯示，與模型組比較，中藥組和陽性藥組大鼠腦組織基因表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表5。

3 ?討論

氣虛血瘀夾痰是缺血性中風(fēng)主要病因病機(jī)。氣虛為本，血瘀為標(biāo)，瘀血既成，影響氣生血及行血，又使腦絡(luò)瘀阻加重。血瘀是缺血性中風(fēng)的病理核心，氣虛是本病的根源;痰是臟腑功能失調(diào)的一種病理產(chǎn)物，亦是導(dǎo)致缺血性中風(fēng)的基本病理因素之一。故缺血性中風(fēng)治以益氣活血、祛痰通絡(luò)，則血行氣旺，血足氣暢，絡(luò)通風(fēng)消，諸癥痊愈。芪蛭膠囊具有益氣活血、化瘀祛痰、通經(jīng)活絡(luò)功效。方中黃芪為君藥，性甘溫，大補(bǔ)元?dú)?，氣足則血生，氣旺促血行;輔以水蛭、地龍破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò);丹參補(bǔ)血、活血化瘀;水蛭、地龍與丹參等同用，旨在祛瘀通絡(luò)、活血化瘀而不傷正。諸藥合用，共奏益氣活血、祛瘀化痰、通經(jīng)活絡(luò)功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、拮抗內(nèi)皮素的釋放及興奮性氨基酸的毒性作用;并能降低血管通透性，改善缺血后血液流變性[5]205;水蛭肽具有抗腦缺血、保護(hù)神經(jīng)元、減輕細(xì)胞損傷的作用[5]221;丹參素具有抗缺血缺氧、抗自由基、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高等作用，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[5]266;地龍活性提取物具有減少或修復(fù)因腦缺血引起的組織損傷和增加腦血流量、減少腦血管阻力、降低血小板黏附和抑制動(dòng)物體內(nèi)血栓形成等作用[5]281。

MARCKS控制大腦中各種細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)相互作用。MARCKS能通過PKC將細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。在大腦中，MARCKS富含在軸突末端和樹突棘，在突觸前末梢中，MARCKS與突觸蛋白Ⅰ相互作用，與突觸小泡共存，并被PKC磷酸化[1]。MARCKS作為PKC的特異性底物蛋白，是大腦中表達(dá)豐富的聯(lián)系神經(jīng)元表面信號(hào)與樹突棘可塑性的重要膜蛋白[6]。PKC在腦缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵性作用，再灌注早期內(nèi)源性δPKC活化介導(dǎo)的一系列傷害性級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)的氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥反應(yīng)與再灌注損傷密切相關(guān)。腦損傷時(shí)，MARCKS大量表達(dá)，并且MARCKS在PKC的作用下，發(fā)生磷酸化反應(yīng)生成p-MARCKS，可參與跨膜信息傳遞與腦組織的發(fā)育[7]，參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、黏附、分泌及細(xì)胞的內(nèi)攝、外放和吞噬作用[7-8]。缺血性中風(fēng)發(fā)作時(shí)，MARCKS蛋白上調(diào)，通過PKC的磷酸化反應(yīng)生成大量的p-MARCKS蛋白，參與細(xì)胞的跨膜傳遞并調(diào)節(jié)細(xì)胞機(jī)能。另外，有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中MARCKS升高對(duì)海馬的可塑性和功能有害[9]，凱尼克酸誘導(dǎo)癲癇發(fā)作導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化，其機(jī)制是上調(diào)MARCKS的mRNA和蛋白表達(dá)[10]。

腦缺血中風(fēng)梗死病灶由中心壞死區(qū)及其周圍的缺血區(qū)半暗帶組成。中心壞死區(qū)由于嚴(yán)重的完全性缺血致腦細(xì)胞死亡;而缺血半暗帶因仍有側(cè)支循環(huán)存在，可獲得部分血液供給，尚有大量存活的神經(jīng)元，理論上認(rèn)為如果血流迅速恢復(fù)，損傷仍為可逆性，據(jù)此提出超早期治療，采取腦保護(hù)措施減輕再灌注損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪蛭膠囊組能改善缺血區(qū)腦組織細(xì)胞形態(tài)，降低神經(jīng)功能缺損，對(duì)大鼠局灶性腦缺血具有明顯的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)，MARCKS蛋白及基因表達(dá)均高于假手術(shù)組和給藥組，因缺血缺氧導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，而小膠質(zhì)細(xì)胞大量存活，激活了與保護(hù)/損傷相關(guān)的PKC-MARCKS信號(hào)通路，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死。芪蛭膠囊能下調(diào)缺血性中風(fēng)大鼠腦組織MARCKS蛋白及其磷酸化蛋白和mRNA的表達(dá)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生。有研究表明，腦缺血狀態(tài)下大鼠缺血區(qū)腦組織MARCKS和p-MARCKS表達(dá)與腦缺血神經(jīng)元損傷關(guān)系密切[11]，芪蛭膠囊治療缺血性中風(fēng)的機(jī)制可能是通過下調(diào)缺血區(qū)大鼠腦組織MARCKS蛋白的表達(dá)，抑制PKC-MARCKS信號(hào)通路的激活及小膠質(zhì)細(xì)胞的生成，進(jìn)而減輕腦缺血對(duì)模型大鼠的損傷。

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（收稿日期：2019-06-01）

（修回日期：2019-07-01;編輯：華強(qiáng)）