ATP生物發(fā)光法在噴氣燃料微生物檢測中的應(yīng)用

孫新楓 熊云 牛明明

摘 ?????要：近年來，由于微生物污染帶來的噴氣燃料儲存和使用問題日漸增多。噴氣燃料中微生物的快速檢測是有效治理微生物污染的前提。本文采用HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)對ATP生物發(fā)光法在噴氣燃料微生物檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，該方法與國標(biāo)平皿計(jì)數(shù)方法在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)（R2=0.960 1），但也存在振蕩標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、萃取液萃取不完全、知識產(chǎn)權(quán)受限和耗材昂貴等諸多問題。最后展望了ATP生物發(fā)光法和濾膜集菌法未來的發(fā)展前景，對研制具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的噴氣燃料微生物檢測設(shè)備具有指導(dǎo)意義。

關(guān) ?鍵 ?詞：噴氣燃料;微生物;ATP生物發(fā)光法;應(yīng)用

中圖分類號：TE 626.23 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）01-0088-04

Abstract： In recent years， the storage and usage problems of jet fuel caused by microbial contamination are increasing. Rapid detection of microorganisms in jet fuel is a prerequisite for the effective treatment of microorganisms. In this paper，HY-LiTE? JET A1 fuel test was used to study the application of ATP bioluminescence method in the microbial detection of jet fuel. The results showed this method was positively correlated with the national standard of plate counting method （R2=0.960 1） in a certain range， however there were many problems， such as inconsistent oscillation criteria， incomplete extraction， limited intellectual property rights and expensive materials. The prospects of ATP bioluminescence method and filter membrane method were briefly discussed， which has guiding significance for the development of microorganism detection equipment for jet fuel with independent intellectual property rights.

Key words： Jet fuel; Microorganisms; ATP bioluminescence method; Application

ATP生物發(fā)光法是一種能夠快速檢測活體微生物數(shù)量的方法，其基本原理[1-3]是熒光素酶（Luciferase）以蟲熒光素（Luciferin）、ATP和O2為底物，在Mg2+作用下，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。DEustachio[4]和Levin[5]研究發(fā)現(xiàn)處于各生長期的微生物，均含有較為穩(wěn)定的ATP含量。James[6]和Sevin[7，8]研究表明，當(dāng)ATP含量處在一定濃度范圍內(nèi)，活細(xì)胞數(shù)與ATP發(fā)光值之間存在著良好的線性關(guān)系。而當(dāng)微生物死亡后，在細(xì)胞酶的作用下，ATP會很快被分解。因此可用ATP生物發(fā)光法來測定活菌數(shù)。

噴氣燃料中不可避免的會存在微生物污染，給儲存安全和飛行安全帶來重大安全隱患[9]。目前國際上尚未形成統(tǒng)一的噴氣燃料微生物檢測方法。本文通過采用基于ATP生物發(fā)光原理的HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)對梯度實(shí)驗(yàn)、人工振蕩效果和振蕩器振蕩效果進(jìn)行研究，探究其在現(xiàn)場快速檢測的可行性，為建立適合我國的噴氣燃料微生物污染評價方法提供新思路。

1 ?儀器與試劑

儀器：HY-LITE2 檢測儀器，德國默克公司;萃取液漩渦振蕩器X-Vortex和樣品混合振蕩器X-Oscillator，上海迅捷華智有限公司;恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、移液槍（100～1 000μL）、無菌吸管、1L樣品瓶。

試劑：XX油庫使用罐儲存的3號噴氣燃料、沙保仕培養(yǎng)基、5%生理鹽水（自配）、局限青霉標(biāo)準(zhǔn)菌液。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)菌液計(jì)數(shù)

將純種局限青霉接種于500 mL沙保仕液體培養(yǎng)液中，置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用作標(biāo)準(zhǔn)菌液。以GB 4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) ?菌落總數(shù)測定》方法，對該標(biāo)準(zhǔn)菌液進(jìn)行10倍、100倍及1 000倍梯度稀釋并進(jìn)行培養(yǎng)，測定該菌液中的菌落數(shù)。

2.2 ?HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)的梯度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將局限青霉標(biāo)準(zhǔn)菌液用無菌生理鹽水分別稀釋2倍、5倍、10倍和100倍，稀釋倍數(shù)與菌落數(shù)關(guān)系如表1所示。在原液和四個稀釋液中分別取1 mL菌液加入到五個裝有1 L無菌噴氣燃料的樣品瓶中，制備成相應(yīng)稀釋倍數(shù)的含菌噴氣燃料?；旌蠐u勻后，靜置5 min。HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)的方法步驟如圖1所示，對每個稀釋度的含菌噴氣燃料，各進(jìn)行兩次測量，測定其熒光值，以菌落數(shù)（CFU/mL）為X軸，熒光值（RLU）為Y軸，繪制菌落數(shù)與熒光值之間的線性關(guān)系圖。

2.3 ?HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)的人工振蕩實(shí)驗(yàn)

用無菌吸管吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)菌液，加入到HY-LiTE測試筆的萃取液中，靜置5 min。待菌液與萃取液混合均勻后，將測試棒取出，將測試棒插入到裝有藍(lán)色萃取液的筆管中充分蘸取萃取液，而后將測試棒全部壓進(jìn)筆管中，順時針旋轉(zhuǎn)測試筆，確保保護(hù)膜被捅破，露出黑色。最后將測試筆放入到HY-LITE光度儀中，測定其熒光值，作為1mL菌液的熒光真值。

取4 L無菌噴氣燃料分裝在4個樣品瓶中，每個樣品瓶中分別加入1 mL局限青霉標(biāo)準(zhǔn)菌液，充分搖勻。四名實(shí)驗(yàn)員分別為男A、男B、女A和女B，按照HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)的方法步驟，嚴(yán)格控制樣品瓶搖晃30 s和測試筆振蕩20 s的時間限制。每個實(shí)驗(yàn)員對一個樣品瓶進(jìn)行微生物檢測。記錄四名實(shí)驗(yàn)員所測的熒光值。

2.4 ?振蕩器的振蕩效果研究

為了解決人為振蕩標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的問題，上海迅捷華智公司研制了萃取液漩渦振蕩器X-Vortex和樣品混合振蕩器X-Oscillator（見圖2），并對轉(zhuǎn)速進(jìn)行了限定。萃取液漩渦振蕩器X-Vortex設(shè)定轉(zhuǎn)速在400～700 r/min之間，樣品混合振蕩器X-Oscillator設(shè)定轉(zhuǎn)速在五檔。

在4個含1 L無菌噴氣燃料的樣品瓶中，分別加入1 mL局限青霉標(biāo)準(zhǔn)菌液，采用人工振蕩和振蕩器的方法各對兩個樣品瓶進(jìn)行測定，測定不同振蕩方法的RLU值，對振蕩器的振蕩效果進(jìn)行評估。

3 ?結(jié)果和分析

3.1 ?標(biāo)準(zhǔn)菌液計(jì)數(shù)

按照GB 4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) ?菌落總數(shù)測定》方法，將菌液稀釋10倍、100倍和1 000倍，所得稀釋液培養(yǎng)皿如圖3所示。

從表2中可以看出，100倍稀釋液的菌落數(shù)平均值是238 CFU/mL。因此，該局限青霉標(biāo)準(zhǔn)菌液的菌落數(shù)大致為2.4×104 CFU/mL。

3.2 ?梯度實(shí)驗(yàn)效果分析

在相同的操作條件下，使用HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)對不同稀釋度的含菌噴氣燃料進(jìn)行檢測，所檢測熒光值和線性相關(guān)圖如表3和圖4所示。從圖4中可以得出，測定的RLU值與噴氣燃料中的菌落數(shù)的相關(guān)系數(shù)R2是96.01%，說明了二者之間有著良好的線性相關(guān)性。但是從表3中可以看出，不同稀釋度菌液燃料測量結(jié)果的相對極差都在20%以上，測量重復(fù)性差。當(dāng)微生物處于較大（24 000 CFU/mL）或較小濃度（2 400 CFU/mL）時，測量結(jié)果的相對極差分別達(dá)到27%和39%，這表明該檢測方法在噴氣燃料中的微生物濃度較大（20 000 CFU/mL）或較小（2 500 CFU/mL）時，1 mL萃取液在噴氣燃料中無法均勻有效地將其中的微生物萃取出來，從而造成檢測結(jié)果偏差較大。

3.3 ?HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)的人工振蕩效果分析

不同的操作人員，由于振蕩頻率、振蕩幅度和振蕩方向不同，萃取的程度也有所不同。檢測結(jié)果見表4。

從表4中可以看出，男操作員力度比女操作員要大一些，因此測量數(shù)值更接近于真值（1 mL局限青霉標(biāo)準(zhǔn)菌液的熒光值是8 600 RLU），兩個男操作員之間和兩個女操作員之間也存在著細(xì)微差別。男操作員的相對平均偏差是-14.54%，而女操作員的相對平均偏差是-22.09%。因此，HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)方法受人為因素影響較大，當(dāng)菌液真實(shí)濃度處在兩個門限值（RLU值為1 000和5 000）時，容易產(chǎn)生污染等級判斷偏低的結(jié)果，給噴氣燃料使用帶來隱形的安全威脅。

3.4 ?振蕩器的振蕩效果分析

采用萃取液漩渦振蕩器X-Vortex和樣品混合振蕩器X-Oscillator對振蕩標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)一，檢測結(jié)果見表5。從表5中可以看出，振蕩器測得結(jié)果穩(wěn)定性要比人工振蕩的方法要高，但人工振蕩的方法更加接近真值，相對平均偏差只有-13.37%，而通過振蕩器振蕩的方法，相對平均偏差竟高達(dá)-60.04%，因此，人工振蕩的方法無論是從經(jīng)濟(jì)成本還是萃取效果上，都要優(yōu)于振蕩器方法。

4 ?結(jié)論和展望

通過對HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)的研究，可以看出噴氣燃料中含菌數(shù)與 HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)檢測的熒光值有著良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)96.01%，因此，ATP生物發(fā)光法可以用于噴氣燃料微生物污染的檢測。但是無論是人工振蕩還是振蕩器振蕩， HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)測量結(jié)果皆有較大誤差，萃取效果不高，同時由于知識產(chǎn)權(quán)受限和單次檢測成本過高（測試筆398元/只），若直接采用HY-LiTE? JET A1燃料試驗(yàn)進(jìn)行快速檢測，無論是成本還是測量準(zhǔn)確度均達(dá)不到理想效果。

采用濾膜集菌的方法，可以很好的解決萃取不完全的問題。目前，濾膜集菌技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得比較成熟。劉弋青[10]、羅祎[11]、嵇志遠(yuǎn)[12]、Namvar[13]、Parveen[14]等專家學(xué)者已經(jīng)采用了微孔濾膜集菌的方法進(jìn)行微生物ATP熒光檢測，并取得了良好的檢測效果。因此可將濾膜集菌方法與ATP熒光法結(jié)合，研制具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的噴氣燃料微生物快速檢測設(shè)備，目前本課題組已率先開展了此項(xiàng)工作，并與寧波博奧生物科技有限公司研發(fā)了第一代儀器（目前正在測試）。因此，基于濾膜集菌的ATP生物熒光法在噴氣燃料微生物污染情況的測定上具有十分廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mcelroy W D， Stremer B L. Factors influencing the Response of the Bioluminescent to Adenosine Triphosphate[J]. Arch.Bioch- enl，1949，22：420-433.

[2]Marlene Deluca，William D.Mcelroy.Kinetics of the Firefly Lucif-erase Catalyzed Reactions[J]. Biochemistry， 1974， 13 （5）： 921-925.

[3] LaRossa R A. Methods in Molecular Biology， Vol 102：Biolumi- nescence Methods and protocols[M]. Totowa， New Jersey： Humana press，1998：3-20.

[4] 舒柏華， 趙志耀， 徐順清， 周宜開. 利用生物發(fā)光分析技術(shù)快速檢測微生物的方法學(xué)研究[J]. 發(fā)光學(xué)報，1999（01）：79-82.

[5] Chappele E W， Levin G V. Method for radiorespirometric detection of bacteria in pure culture and in blood[J].Biochem Med，1968，2：41-52.

[6] James D M，Hendrson F. Nucleoside triphosphate speci-ficity of firely luciferase[J]. Analytical Biochemistry，1983，19（11）：194.

[7]Sevin BU，Peng Z I，Perras J P，et al.Application of an ATP bio- luminescence assay in human tumor chemosensitivity testing[J]. Gynecol oncol，1988，31（1）：191-204.

[8] Sevin B U， Peng Z I， Averette H E， et al.Chemosensitivity testing in ovarian cancer[J].Cancer，1993，71（4）：1613-1620.

[9] 李鵬，熊云，陳然. 噴氣燃料中微生物污染危害研究概述[J]. 當(dāng)代化工，2017，46（02）：333-335+349.

[10] 劉弋青， 呂維敏， 劉魁武，等. 基于濾膜上細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法的細(xì)菌總數(shù)快速檢測[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程研究，2009，28（1）：60-62.

[11]羅祎， 趙晉府， 周爾明. 微生物檢測國標(biāo)法和濾膜法的比較[J]. 食品工業(yè)技，1999，20（6）：54-56.

[12] 嵇志遠(yuǎn)， 翁天楚. 三種方法測定水中糞便污染指示菌比較研究[J]. 工業(yè)水理，2013，33（10）：79-82.

[13] Azadeh Namvar， Haq I，Shields M， er al. Extration of Bacillus endospores from water， apple juice concentrate， raw milk and ?lettuce rinse solutions using tangential flow filtration[J].Food Control，2013，32（2）：632-637.

[14] Parveen S，Kaur S，David S A， et al. Wilson D，et al.Evaluation of growth based rapid microbiological methods for sterility testing of vaccines and other biological products [J]. Vaccine， 2011， 29 （45）：8012-8023.