• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    苜蓿青貯中微生物種群分析及主要菌種的篩選鑒定

    2019-12-12 07:32:06馬召穩(wěn)李元曉王占彬
    草業(yè)科學(xué) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:青貯飼料苜蓿球菌

    馬召穩(wěn),李元曉,梁 含,王占彬,李 旺

    (河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,河南 洛陽 471023)

    紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培面積最大的豆科牧草,再生能力強(qiáng),抗逆性好,生長速度快,營養(yǎng)豐富,有“飼草之王”的美稱[1]。當(dāng)前我國苜蓿產(chǎn)品主要以調(diào)制青干草為主,但調(diào)制干草的過程中因雨淋、落葉等因素使?fàn)I養(yǎng)成分損失較大[2-3]。青貯是保存青飼料營養(yǎng)物質(zhì)的有效方法。該方法是一個(gè)復(fù)雜的微生物區(qū)系變化過程,涉及到乳酸菌、腐敗菌、酵母菌、霉菌、芽胞桿菌等多種微生物[4],這些微生物存在于青貯原料、青貯發(fā)酵過程中和發(fā)酵完成后等所有時(shí)期,并與青貯原料種類和青貯時(shí)期有很大關(guān)系[5-6]。其中乳酸菌是青貯發(fā)酵成功的關(guān)鍵微生物[7]。

    微生物青貯添加劑可有效縮短青貯飼料制作時(shí)間,提升青貯飼料制作的成功率,提高青貯飼料品質(zhì)。目前主要使用的微生物菌種有乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)及部分芽孢桿菌屬(Bacillus)等。研究發(fā)現(xiàn),利用枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和植物乳桿菌(L. plantarum)組合對玉米(Zea mays)進(jìn)行青貯,制作的青貯飼料品質(zhì)優(yōu)良[8]。添加凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)、植物乳桿菌、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)和乳酸片球菌(P. acidilactici)的全株玉米青貯在感官評價(jià)上均優(yōu)于未添加微生物的自然發(fā)酵組[9]。

    苜蓿青貯的制作要通過晾曬使水分降至65%左右制成半干青貯或者依靠青貯添加劑[10-13]。苜蓿青貯常用的微生物添加劑為乳酸菌,乳酸菌能夠利用發(fā)酵糖分產(chǎn)生乳酸,快速降低其pH,有效抑制霉菌等有害微生物的活動,從而降低青貯飼料養(yǎng)分損失提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[2,14]。王麗學(xué)等[15]利用5種乳酸菌對紫花苜蓿進(jìn)行青貯發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌和乳酸片球菌能夠顯著提高青貯品質(zhì)。然而,有研究表明僅添加乳酸菌,能夠降低有氧穩(wěn)定性[16],通過添加乳桿菌、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)及不可培養(yǎng)酸桿菌對苜蓿進(jìn)行裹包青貯,發(fā)現(xiàn)3種菌劑能夠顯著提高苜蓿青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性[17]。由于青貯原料的差異,導(dǎo)致苜蓿青貯過程微生物種群變化情況存在很多未知。

    隨著研究的深入,很多報(bào)道從基因水平研究青貯飼料微生物種群組成。徐振上[18]使用16S rDNA宏基因組技術(shù)對玉米青貯過程中細(xì)菌群落變化進(jìn)行分析,結(jié)果顯示厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteriodetes)三者占據(jù)了菌群的95%以上。本研究旨在通過分子生物學(xué)技術(shù)對苜蓿青貯的微生物菌群進(jìn)行分析,篩選適合苜蓿青貯的微生物菌種,并對其進(jìn)行鑒定,開發(fā)苜蓿青貯微生物添加劑,改善苜蓿青貯的品質(zhì)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    苜蓿品種為阿爾岡金(Algonquin),河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)翀龇N植第3年,春季第1茬,初花期刈割后在試驗(yàn)田晾曬24 h,用于苜蓿青貯制作。

    培養(yǎng)基[19]有:MRS培養(yǎng)基[葡萄糖4 g,胰蛋白胨2 g,酵母提取物1 g,牛肉膏2 g,MnSO4·4H2O 0.007 6 g,MgSO4·7H2O 0.04 g,Tween-80 0.2 mL,K2HPO40.4 g,檸檬酸胺0.4 g (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g),無菌水200 mL,pH 6.2~6.4];LB培養(yǎng)基[胰蛋白胨2 g,酵母提取物1 g,氯化鈉2 g (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g),無菌水200 mL,pH 7.0~7.2];NA培養(yǎng)基[牛肉膏0.6 g,蛋白胨2 g,氯化鈉1 g,無菌水200 mL (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g),pH 7.2];PDA培養(yǎng)基[去皮馬鈴薯40 g,加入200 mL無菌水煮沸20 min,雙層紗布過濾后補(bǔ)充水至200 mL,加入葡萄糖4 g (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g),121 ℃高壓滅菌20 min,用乙醇溶解0.02 g氯霉素,加入培養(yǎng)基中];麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基[葡萄糖0.2 g,氯化鉀0.36 g,酵母粉0.5 g,乙酸鈉1.64 g (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g),蒸餾水200 mL]。

    主要試劑:細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,生化試劑購自TAKARA生物公司,其他化學(xué)試劑均為分析純,購自洛陽博冠商貿(mào)有限公司。

    采用通用引物[20],上游:5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAC-3′,下游:5′-AAGGAGGTGATCCAG CC-3′,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 苜蓿青貯的制作

    將刈割的紫花苜蓿晾曬至水分含量為65%左右時(shí),用剪刀剪成1 cm長的小段,裝入500 mL廣口瓶中,壓實(shí)密封,厭氧發(fā)酵,制作3瓶,每瓶為1個(gè)重復(fù)。

    1.2.2 苜蓿青貯品質(zhì)評定[21]

    青貯第60天取樣,3個(gè)重復(fù)取樣后混合均勻,由具有青貯飼料質(zhì)量評估經(jīng)驗(yàn)的3人做現(xiàn)場感官評分,評定標(biāo)準(zhǔn)參考《德國DLG青貯飼料感觀評分標(biāo)準(zhǔn)》[22]分為優(yōu)(20~16分)、良(15~10分)、中(9~5分)和下(4~0分) 4個(gè)等級。評分內(nèi)容為嗅覺、結(jié)構(gòu)和色澤:嗅覺分5個(gè)等級(0~14分);結(jié)構(gòu)分4個(gè)等級(0~4分);色澤分3個(gè)等級(0~2分)。

    1.2.3 苜蓿青貯樣品宏基因組測序分析

    由美因健康科技(北京)有限公司協(xié)助完成。

    細(xì)菌基因組DNA的提取與質(zhì)量檢測:將苜蓿青貯3個(gè)重復(fù)各取3 g樣品混合均勻,按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明進(jìn)行苜蓿青貯中細(xì)菌全基因組DNA的提取,利用Nanodrop檢測DNA的純度和濃度,并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性,然后利用Qubit3.0對DNA濃度進(jìn)行精確定量。

    宏基因組文庫的構(gòu)建及質(zhì)量檢測:使用Covaris超聲波破碎儀進(jìn)行隨機(jī)打斷,選取合適長度的片段,經(jīng)過末端修復(fù)、3′端加A、加接頭、純化、擴(kuò)增等完成宏基因組文庫制備,文庫的質(zhì)量檢測為:用Qubit3.0對文庫初步定量并稀釋至1 ng·μL-1→Qsep100對文庫的Insert Size檢測→利用Q-PCR對文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。宏基因組文庫質(zhì)檢合格后按照有效濃度和目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行上機(jī)測序,測序策略為Illumina Hiseq,PE150。

    測序完成后,對原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制(Raw Data)、拼接組裝、基因預(yù)測并構(gòu)建非冗余基因集(gene catalogue),然后對得到的基因進(jìn)行物種和功能上的注釋、分類以及豐度統(tǒng)計(jì),在上述分析的基礎(chǔ)之上,對樣品或樣品組間進(jìn)行相似聚類,分組排序,差異比較等多方向的統(tǒng)計(jì)分析,并對結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

    1.2.4 微生物菌種的篩選

    微生物的篩選方法參考文獻(xiàn)[7]的操作方法作進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整。在超凈臺中將10 g青貯樣品剪碎后放入90 mL無菌水混合于150 mL三角瓶中,封口膜封口,置于搖床上震蕩30 min,配置1 × 10-2、1 × 10-3、1 × 10-4共3種稀釋梯度,取50 μL稀釋液滴在MRS、NA、LB、PDA以及麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上,用涂布棒將菌液在培養(yǎng)基上涂抹均勻,然后將培養(yǎng)基倒轉(zhuǎn)靜置20~30 min,將MRS和麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基在37 ℃厭氧、NA、LB、PDA在37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24~48 h,分離微生物。

    1.2.5 微生物菌株的鑒定

    形態(tài)學(xué)鑒定:對所篩菌種進(jìn)行純培養(yǎng),分別在不同的固體培養(yǎng)基上,觀察菌落的形態(tài)、顏色、大小、光澤等菌落特征,用接種環(huán)分別挑取單菌落,進(jìn)行革蘭氏染色[23],顯微鏡下觀察菌體顏色、大小、形狀、是否有芽孢等菌體特征。

    分子生物學(xué)鑒定:參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書,提取所篩菌種基因組DNA,擴(kuò)增菌種的16S rDNA保守序列。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,并通過NCBI Blast N進(jìn)行保守序列的分析比對。PCR擴(kuò)增體系為25 uL體系,包括:① 10 × Ex Taq buffer:2.5 μL,② dNTP:2 μL,③ 上游引物:1 μL,④ 下游 引物:1 μL,⑤ Ex Taq酶:0.5 μL,⑥ 模板(基因組DNA):1 μL,⑦ ddH2O:17 μL。PCR反應(yīng)條件及程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 2 min→35個(gè)循環(huán)(變性94 ℃30 s→復(fù)性57 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 1 min30 s)→終延伸72 ℃ 10 min→4 ℃保存。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 苜蓿青貯質(zhì)量評定

    對所制作的苜蓿青貯樣品進(jìn)行品質(zhì)評定,氣味評分10.78,結(jié)構(gòu)評分3.22,色澤評分1.56,綜合評分15.56,結(jié)果顯示,青貯品質(zhì)評定等級為良好。

    2.2 苜蓿青貯中微生物種群分析

    2.2.1 宏基因組文庫基因信息分析

    通過構(gòu)建宏基因組文庫,從苜蓿青貯樣品中篩選和組裝了60 710個(gè)基因樣品,通過測序得知這些基因總長度為39 948 615 bp,平均長度為720.04 bp,對其進(jìn)行了編號并計(jì)算了基因豐度信息。將這些基 因 在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫與Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST(balst p)比對分析和功能注釋;經(jīng)過分析苜蓿青貯宏基因組中的基因主要涵蓋6大功能類:糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)、糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶(glycosyl transferases,GTs)、多糖裂合酶(polysaccharide lyases,PLs)、碳水化合物酯 酶(carbohydrate esterases,CEs)、輔 助 氧 化 還 原酶(auxiliary activities,AAs)和碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding modules,CBMs)。

    2.2.2 宏基因組文庫物種信息分析

    圖 1 苜蓿青貯中微生物菌種群落分析Figure 1 Analysis of microbial communities in alfalfa silage

    利用宏基因組測序技術(shù)擴(kuò)增苜蓿青貯中微生物保守序列,并對基因豐度在0.1%以上的基因序列進(jìn)行相似性分析和比對(圖1)??梢钥闯?,相似性大于95%水平上的微生物物種共有53 587個(gè),分屬18個(gè)門,28個(gè)綱,59個(gè)目,87個(gè)科,207個(gè)屬,672個(gè)微生物物種。厚壁菌門物種基因豐度可達(dá)99.4%,為主要優(yōu)勢微生物群落。序列測定基于目水平的分析,微生物群落數(shù)為51 822個(gè),主要以芽孢桿菌目(Bacillales)和乳酸菌目(Lactobacillales)為主,分別占到目水平微生物群落總數(shù)的64.5%和18.9%?;趯俚乃娇煞治觯⑸锶郝淇倲?shù)為43 502個(gè),其主要微生物群落為海洋桿菌屬(oceanobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacilli)、芽孢桿菌屬(Bacilli)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、乳酸球菌屬(Lactococcus)以及部分梭菌屬(clostridium)等。其所占比例分別達(dá)到了24.9%、14.3%、13.9%、13.2%、5.8%、4.1%。

    在種的水平對苜蓿青貯微生物菌種分析,結(jié)果顯示芽孢桿菌菌種所占的比例較大,主要有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai),短小芽孢桿菌(B. pumilus)以及尚未鑒定到種的部分芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)。海洋桿菌屬的微生物菌種主要為O. damuensis及未鑒定到種的部分Oceanobacillussp.菌株。乳桿菌屬微生物菌種主要有植物乳桿菌及短乳桿菌(L. brevis)等。乳酸球菌屬的微生物菌種主要為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和乳酸片球菌。腸球菌屬的菌株主要是糞腸球菌(E. faecalis)和屎腸球菌(E. faecium)。枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)的菌種主要為V. pantothenticus、V. halodenitrificans以及V. alimentarius等。

    2.3 苜蓿青貯主要微生物菌種的篩選

    利用MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)的方式從苜蓿青貯中共篩選出13株菌株,暫命名為MRS1、MRS2、MRS3、MRS4、MRS5、MRS6、MRS7、MRS8、MRS9、MRS10、MRS11、MRS12、MRS13;利用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基厭氧培養(yǎng)方式篩選出3株菌株,暫命名為MC1、MC2、MC3;PDA培養(yǎng)基好氧培養(yǎng)篩選出8株菌株,暫命名為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8;利用NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基好氧培養(yǎng)分別從苜蓿青貯中篩選出2株和4株菌株,暫命名為NA1、NA3和LB2、LB5、LB6、LB7。

    2.4 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

    2.4.1 菌株的菌落特征鑒定結(jié)果

    從苜蓿青貯中分離出的菌株MRS1~13、MC1~3及NA1的菌落特征為圓形、邊緣整齊、表面光滑、中央凸起的乳白色單菌落(圖2A)。菌株P(guān)5、P8、LB2、LB5、LB6菌落表面不光滑,邊緣不整齊,中部有突起的皺褶(圖2B)。菌株P(guān)1~P4、P6、P7、LB7和NA3的菌落呈白色,邊緣不整齊,表面不光滑,有突起的皺褶(圖2C)。

    2.4.2 菌株的菌體特征鑒定結(jié)果

    從苜蓿青貯中分離出的菌株MRS1~9、MRS11、MRS12、MRS13、以及MC1、MC2、MC3革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽性,短桿狀,單個(gè)或呈鏈狀排列(圖3A)。MRS10和NA1革蘭氏染色呈球形,單個(gè)或鏈狀排列的革蘭氏陽性菌(圖3B)。菌株P(guān)DA1~8、LB7和NA3革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽性、桿狀、單個(gè)或短鏈狀排列,芽孢中生或端生(圖3C)。

    圖 2 苜蓿青貯中的部分菌株菌落特征Figure 2 Bacterial colonies in alfalfa silage

    圖 3 苜蓿青貯中篩選出的部分菌株菌體Figure 3 Strains isolated from alfalfa silage

    2.5 分子生物學(xué)鑒定

    提取篩選到的微生物的基因組DNA,以每個(gè)菌種基因組DNA為模板,以細(xì)菌16S rDNA序列通用引物對其保守序列進(jìn)行擴(kuò)增(圖4)??梢钥闯?,所篩菌種均成功擴(kuò)增出大小約1 500 bp左右的DNA片段。對擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測定,將序列測定結(jié)果經(jīng)NCBI Blast N進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)菌株MRS1~MRS9和MRS11~MRS13以及MC1~MC3與植物乳桿菌(MG551233.1)的相似度達(dá)到了99.8%;菌株MRS10與乳酸片球菌菌株(KY550661.1)的相似度達(dá)到98.42%;菌株NA1與糞腸球菌(CP028727.1)的相似度達(dá)到了98.80%;菌株LB6與阿氏芽孢桿菌(KU052707.1)的相似度達(dá)到了99.44%;菌株P(guān)1~P4、P6、P7、LB7、NA3與枯草芽孢桿菌菌株(KC422328.1)相似度達(dá)到99.58%;菌株LB5、P5與地衣芽孢桿菌菌株(CP035404.1)的相似度達(dá)到了99.92%;菌株P(guān)8與短小芽孢桿菌菌株(KC692158.1)的相似度達(dá)到了99.55%。菌株LB2與解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)菌株(CP029071.1)的相似度達(dá)到了99.63%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定,初步確定從苜蓿青貯樣品中篩選到植物乳桿菌15株,乳酸片球菌和糞腸球菌各1株,各種芽孢桿菌12株。說明苜蓿青貯樣品中的微生物菌種以乳酸菌和芽孢桿菌為主。

    3 討論與結(jié)論

    本研究采用宏基因組測序技術(shù)對苜蓿青貯中微生物菌落進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,厚壁菌門微生物的基因豐度高達(dá)99.4%,其中海洋桿菌屬、乳酸桿菌屬以及芽孢桿菌屬等基因豐度較大,與徐振上[18]在青貯玉米中微生物菌群分布的研究結(jié)果相似。但本研究在屬的水平分析的微生物物種與已有報(bào)道差異較大,可能的原因是青貯原料差別所引起,也可能與樣品開封后在氧氣中暴露的程度有關(guān)[6,24]。

    在青貯飼料菌種篩選上,有報(bào)道從青貯玉米及苜蓿青貯中篩選出不同的微生物菌種。李旭嬌和玉柱[25]利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法從苜蓿青貯飼料中篩選到4株植物乳桿菌。韓吉雨[26]通過對青貯發(fā)酵體系中乳酸菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn),玉米青貯飼料在發(fā)酵第60天時(shí)篩選出的微生物有植物乳桿菌。張慧杰等[27]從阿爾岡金和敖漢兩個(gè)品種的紫花苜蓿青貯飼料中篩選到了乳酸片球菌。韓吉雨[26]篩選出的與乳酸片球菌特征一致的菌種,說明乳酸片球菌是苜蓿青貯的另一個(gè)主要菌種。除了乳酸菌之外,張濤[28]、席琳喬等[29]分別在苜蓿青貯和青貯玉米中篩選到地衣芽孢桿菌的近緣菌種。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生具有抑制酵母和霉菌的細(xì)菌素,能夠顯著提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[30],并參與青貯飼料的整個(gè)發(fā)酵過程。

    本研究篩選到植物乳桿菌15株,乳酸片球菌和糞腸球菌各1株,各種芽孢桿菌12株。與已有報(bào)道結(jié)果基本一致,說明乳酸菌和芽孢桿菌是青貯飼料的主要微生物菌種[25,28]。傳統(tǒng)微生物篩選方法不能完全獲得青貯飼料微生物種群的信息。本研究通過宏基因組測序分析了苜蓿青貯中的主要微生物類群,并通過配制相應(yīng)的培養(yǎng)基篩選到主要的微生物菌種,對微生物種屬的鑒定結(jié)果與宏基因組測序分析結(jié)果相一致。說明宏基因組測序技術(shù)能夠有效分析苜蓿青貯樣品中的微生物組成和種群信息,為篩選和使用苜蓿青貯中的微生物提供很大幫助。

    猜你喜歡
    青貯飼料苜蓿球菌
    一株禽源糞腸球菌的分離與鑒定
    兩種不同青貯劑對青貯飼料品質(zhì)的影響
    苜蓿的種植及田間管理技術(shù)
    苜蓿的種植技術(shù)
    青貯飼料在肉牛養(yǎng)殖中的使用
    湖南飼料(2019年5期)2019-10-15 08:59:12
    結(jié)節(jié)病合并隱球菌病的研究進(jìn)展
    青貯飼料在豬日糧中的的應(yīng)用研究
    苜蓿:天馬的食糧
    中國三峽(2017年4期)2017-06-06 10:44:22
    IL-33在隱球菌腦膜炎患者外周血單個(gè)核中的表達(dá)及臨床意義
    一株副球菌對鄰苯二甲酸酯的降解特性研究
    久久久久视频综合| 亚洲av欧美aⅴ国产| 岛国毛片在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品.久久久| 90打野战视频偷拍视频| 色94色欧美一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 99精国产麻豆久久婷婷| 黄频高清免费视频| 欧美精品一区二区大全| 久久免费观看电影| 只有这里有精品99| 免费在线观看黄色视频的| 极品人妻少妇av视频| 午夜激情久久久久久久| 亚洲一区中文字幕在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产熟女欧美一区二区| 一本色道久久久久久精品综合| 丁香六月欧美| 亚洲精品在线美女| 少妇被粗大的猛进出69影院| 男女下面插进去视频免费观看| 桃花免费在线播放| 一本大道久久a久久精品| 嫩草影视91久久| 91精品三级在线观看| a级毛片在线看网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| av不卡在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲国产日韩一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产熟女午夜一区二区三区| av一本久久久久| 久久 成人 亚洲| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男女无遮挡免费网站观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产视频一区二区在线看| 丝瓜视频免费看黄片| 国产欧美日韩一区二区三 | 久久精品成人免费网站| 亚洲情色 制服丝袜| www日本在线高清视频| 丝袜喷水一区| 男女下面插进去视频免费观看| 91麻豆av在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 18禁国产床啪视频网站| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品自拍成人| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲成人免费电影在线观看 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品久久久久久精品古装| 久久毛片免费看一区二区三区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲综合色网址| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线观看人妻少妇| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲欧洲日产国产| 国产视频一区二区在线看| 另类亚洲欧美激情| 91国产中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 曰老女人黄片| 国产主播在线观看一区二区 | 999精品在线视频| 国产精品二区激情视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久 成人 亚洲| 99久久人妻综合| 老司机影院毛片| 性少妇av在线| 曰老女人黄片| 亚洲第一青青草原| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 91九色精品人成在线观看| 97在线人人人人妻| 欧美激情高清一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 91精品三级在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜福利视频在线观看免费| 免费观看人在逋| 大码成人一级视频| 国产视频一区二区在线看| 亚洲av美国av| 视频区图区小说| 精品国产国语对白av| videos熟女内射| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产视频首页在线观看| 中文字幕制服av| 免费高清在线观看日韩| 十分钟在线观看高清视频www| 高清欧美精品videossex| 国产免费又黄又爽又色| 成人手机av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品国产av蜜桃| 成人亚洲精品一区在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 老司机在亚洲福利影院| 免费看不卡的av| 两性夫妻黄色片| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 丝袜在线中文字幕| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 各种免费的搞黄视频| 日本欧美国产在线视频| kizo精华| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲第一av免费看| 免费看十八禁软件| 99国产精品99久久久久| 免费少妇av软件| 电影成人av| 亚洲国产精品一区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 老鸭窝网址在线观看| 在线观看国产h片| 美女视频免费永久观看网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产男女内射视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 性色av乱码一区二区三区2| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品三级大全| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 日本a在线网址| av一本久久久久| 午夜视频精品福利| 交换朋友夫妻互换小说| 黄色毛片三级朝国网站| avwww免费| 国产精品国产三级专区第一集| xxxhd国产人妻xxx| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久免费观看电影| av国产久精品久网站免费入址| 天天影视国产精品| 午夜av观看不卡| 亚洲av片天天在线观看| 免费看不卡的av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产一区二区激情短视频 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久久欧美国产精品| 一区在线观看完整版| 9191精品国产免费久久| 国产又色又爽无遮挡免| 桃花免费在线播放| 亚洲精品第二区| 亚洲国产日韩一区二区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久精品国产a三级三级三级| 大话2 男鬼变身卡| 免费一级毛片在线播放高清视频 | av在线app专区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 啦啦啦中文免费视频观看日本| tube8黄色片| 伊人亚洲综合成人网| 日本一区二区免费在线视频| 桃花免费在线播放| 各种免费的搞黄视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 午夜激情av网站| 无遮挡黄片免费观看| 国产av精品麻豆| 国产成人av教育| 日日夜夜操网爽| 日韩一区二区三区影片| 午夜免费观看性视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 少妇人妻 视频| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲av综合色区一区| 美女午夜性视频免费| 老司机影院毛片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 老司机亚洲免费影院| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 天堂俺去俺来也www色官网| 视频区欧美日本亚洲| 一边亲一边摸免费视频| 国产在线一区二区三区精| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 男男h啪啪无遮挡| 精品视频人人做人人爽| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 午夜影院在线不卡| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一级毛片我不卡| 两个人免费观看高清视频| 亚洲天堂av无毛| 不卡av一区二区三区| a级片在线免费高清观看视频| av片东京热男人的天堂| 晚上一个人看的免费电影| 国产免费现黄频在线看| 制服人妻中文乱码| 美女中出高潮动态图| 一区在线观看完整版| 女性被躁到高潮视频| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲国产欧美网| 9热在线视频观看99| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲精品一二三| 国产色视频综合| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲专区中文字幕在线| 91成人精品电影| www.av在线官网国产| 少妇人妻久久综合中文| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲国产日韩一区二区| 国产成人欧美在线观看 | 18禁国产床啪视频网站| 国产成人av教育| 久久久久网色| 一区福利在线观看| 久久性视频一级片| 久久久精品94久久精品| 97人妻天天添夜夜摸| kizo精华| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av天堂久久9| 咕卡用的链子| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产在线观看jvid| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久久久精品精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 99久久综合精品五月天人人| 亚洲专区中文字幕在线| 麻豆国产av国片精品| 美女国产高潮福利片在线看| 丝袜美腿诱惑在线| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品色激情综合| 婷婷丁香在线五月| 在线视频色国产色| 美女 人体艺术 gogo| 熟女电影av网| 亚洲av熟女| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲第一电影网av| 一级a爱片免费观看的视频| 国产真实乱freesex| av免费在线观看网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中出人妻视频一区二区| 天天一区二区日本电影三级| 老司机靠b影院| 国产精品一区二区三区四区久久 | 最新在线观看一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 999精品在线视频| 日韩av在线大香蕉| 欧美性长视频在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 色老头精品视频在线观看| 国产av不卡久久| 国产激情久久老熟女| 自线自在国产av| 黄片大片在线免费观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美zozozo另类| 搡老熟女国产l中国老女人| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 两个人看的免费小视频| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 老汉色∧v一级毛片| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 操出白浆在线播放| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲成人免费电影在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费看a级黄色片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产精品亚洲美女久久久| 一进一出好大好爽视频| 美女 人体艺术 gogo| 手机成人av网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久9热在线精品视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜福利在线在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产片内射在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品久久视频播放| 久久热在线av| 国产成人欧美| 亚洲激情在线av| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久久大精品| 精品国产国语对白av| 女性生殖器流出的白浆| 色综合婷婷激情| av有码第一页| 亚洲国产欧美网| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品电影一区二区三区| 久久香蕉国产精品| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美午夜高清在线| 男女那种视频在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91老司机精品| 啦啦啦 在线观看视频| 怎么达到女性高潮| www.999成人在线观看| 一本精品99久久精品77| 在线免费观看的www视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线免费观看的www视频| 制服人妻中文乱码| 亚洲成av片中文字幕在线观看| xxx96com| 久久久久久久久久黄片| 免费在线观看日本一区| 色综合站精品国产| 欧美日本视频| 性色av乱码一区二区三区2| 国产免费男女视频| av视频在线观看入口| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久中文字幕一级| www日本在线高清视频| 国产高清有码在线观看视频 | 日本成人三级电影网站| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产一区二区三区视频了| 禁无遮挡网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产真实乱freesex| 久久久久久人人人人人| 很黄的视频免费| 韩国精品一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 色在线成人网| 精品欧美一区二区三区在线| 久久狼人影院| 日本在线视频免费播放| 99热只有精品国产| 一级毛片女人18水好多| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99国产精品99久久久久| 自线自在国产av| 1024手机看黄色片| 国产精品亚洲一级av第二区| 禁无遮挡网站| 亚洲专区中文字幕在线| 国产亚洲欧美98| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 特大巨黑吊av在线直播 | 高清在线国产一区| 色在线成人网| 两个人视频免费观看高清| 久久99热这里只有精品18| 1024视频免费在线观看| 人人澡人人妻人| 免费在线观看影片大全网站| 日韩欧美免费精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲 国产 在线| 大型av网站在线播放| 色综合婷婷激情| 欧美激情 高清一区二区三区| e午夜精品久久久久久久| 亚洲精品在线美女| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人一区二区视频在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 女人被狂操c到高潮| 国产成人欧美| 亚洲精华国产精华精| 国产精品亚洲美女久久久| 国产午夜精品久久久久久| 午夜久久久久精精品| 美女大奶头视频| 99久久国产精品久久久| 亚洲电影在线观看av| 色播亚洲综合网| 9191精品国产免费久久| 国产高清有码在线观看视频 | 岛国在线观看网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲黑人精品在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 男人操女人黄网站| 神马国产精品三级电影在线观看 | 两个人看的免费小视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜福利18| 免费看十八禁软件| 可以在线观看毛片的网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久久国产成人免费| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 成人午夜高清在线视频 | 狠狠狠狠99中文字幕| 啦啦啦韩国在线观看视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人国产一区最新在线观看| 后天国语完整版免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 日日干狠狠操夜夜爽| 一本综合久久免费| av有码第一页| 国产99久久九九免费精品| 国产欧美日韩一区二区三| www.精华液| 美女午夜性视频免费| 狂野欧美激情性xxxx| 此物有八面人人有两片| 国产欧美日韩一区二区精品| 一区二区三区激情视频| a级毛片在线看网站| 亚洲最大成人中文| 俄罗斯特黄特色一大片| 人人妻人人看人人澡| 18禁国产床啪视频网站| 精品久久久久久久久久久久久 | 丝袜人妻中文字幕| 精品福利观看| 69av精品久久久久久| 国产亚洲精品av在线| 欧美性猛交黑人性爽| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品美女久久av网站| 中文在线观看免费www的网站 | 草草在线视频免费看| 国产v大片淫在线免费观看| 男女午夜视频在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 免费在线观看影片大全网站| 99riav亚洲国产免费| 国产乱人伦免费视频| 欧美黑人精品巨大| 欧美成狂野欧美在线观看| 岛国在线观看网站| 精品免费久久久久久久清纯| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 一进一出好大好爽视频| 欧美中文综合在线视频| 一a级毛片在线观看| 婷婷丁香在线五月| 国产在线观看jvid| 亚洲一区高清亚洲精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 三级毛片av免费| 97碰自拍视频| x7x7x7水蜜桃| 999久久久国产精品视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 后天国语完整版免费观看| 不卡一级毛片| 1024手机看黄色片| 丝袜在线中文字幕| 国产av又大| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产av又大| 悠悠久久av| 日本一区二区免费在线视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 草草在线视频免费看| 可以在线观看毛片的网站| а√天堂www在线а√下载| 久久久久久免费高清国产稀缺| 桃色一区二区三区在线观看| 宅男免费午夜| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久性视频一级片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久久国产精品麻豆| 国语自产精品视频在线第100页| 99精品久久久久人妻精品| 国产真人三级小视频在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久中文字幕一级| 久久精品91蜜桃| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99国产精品99久久久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 男人舔奶头视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 色综合站精品国产| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线观看日韩欧美| 久久亚洲精品不卡| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 欧美三级亚洲精品| 桃色一区二区三区在线观看| 免费在线观看完整版高清| 91在线观看av| 两个人视频免费观看高清| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产色视频综合| 成人三级黄色视频| 国产av一区在线观看免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 日日爽夜夜爽网站| 色播亚洲综合网| 亚洲 国产 在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品久久久久久久毛片微露脸| 女同久久另类99精品国产91| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品日韩av在线免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产av又大| 亚洲国产看品久久| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 特大巨黑吊av在线直播 | 美女国产高潮福利片在线看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 丰满的人妻完整版| av电影中文网址| 午夜免费激情av| 成人三级黄色视频| 丁香六月欧美| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲美女黄片视频| 久久青草综合色| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲真实伦在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 麻豆一二三区av精品| 1024视频免费在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 中文字幕久久专区| 国产精品 国内视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 黄色a级毛片大全视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 此物有八面人人有两片| 男女那种视频在线观看| 欧美zozozo另类| 日韩欧美国产一区二区入口| 日本一本二区三区精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美久久黑人一区二区| а√天堂www在线а√下载| 男人舔女人的私密视频| 制服人妻中文乱码| 成人午夜高清在线视频 | 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 不卡一级毛片| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲九九香蕉| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品 欧美亚洲| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日韩欧美 国产精品| 正在播放国产对白刺激| 51午夜福利影视在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲天堂国产精品一区在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 波多野结衣高清无吗| 黄色a级毛片大全视频| a级毛片在线看网站| 国产野战对白在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 精品久久久久久,| 日日夜夜操网爽|