計算機圖像分析與人工計數(shù)方法在肺癌EGFR免疫組化中的對比研究

丁寧寧 沈陽市第十人民醫(yī)院病理科 （遼寧 沈陽 110000）

內(nèi)容提要： 目的：探討計算機圖像分析取代人工計數(shù)方法在肺癌EGFR免疫組化中的準確性和可行性。方法：回顧性選取2012年7月～2018年5月本院收治的行EGFR免疫組化檢查的101例肺癌患者作為觀察對象。男47例，女54例，年齡39～79歲，平均（61.51±5.53）歲，根據(jù) EGFR蛋白表達情況，比較計算機圖像分析與人工計數(shù)方法的差異性。結(jié)果：在高倍鏡（×400）下，人工計數(shù)的染色程度平均比值（43.61）較圖像采集分析計算的染色程度的平均比值（0.137）顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組方法的一致率為87.93%，Kappa值為0.71，處于0.4～0.75，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論：肺癌EGFR蛋白表達采用計算機圖像分析，定量檢測所得結(jié)果和人工計數(shù)方法的結(jié)果一致性較好，但計算機圖像分析的準確性和客觀性更高。

EGFR免疫組化檢測是肺癌診斷方法中較為常用的一種方法，主要是因為該法能夠準確對組織細胞特異性蛋白質(zhì)進行組織學(xué)定位，具有操作簡便、靈敏度與可重復(fù)性較高的優(yōu)勢，在廣大醫(yī)學(xué)臨床、基礎(chǔ)科研工作者當(dāng)中廣受歡迎。然而，大部分研究EGFR免疫組化的方法，僅根據(jù)人工計數(shù)細胞陽性的個數(shù)或者人為主觀分級陽性表達來分析研究結(jié)果，長此以往，不僅加重工作量，而且研究結(jié)果受研究者主觀因素影響較多，較難作出客觀的評價。隨著計算機技術(shù)在臨床應(yīng)用的迅猛發(fā)展，衍生出很多的圖像分析與處理軟件，但由于在實際應(yīng)用中問題較多，尚不能在臨床有較好的應(yīng)用推廣[1]。本次研究根據(jù)MediaCybernetics公司制作的ImageProPlus圖像分析軟件，通過觀察肺癌EGFR表達，討論計算機圖像分析的可信度。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性選取2012年7月～2018年5月本院收治的行EGFR免疫組化檢查的101例肺癌患者作為觀察對象。男47例，女54例，年齡39～79歲，平均（61.51±5.53）歲。組織學(xué)分型以2011年肺腺癌多學(xué)科新國際分類為標準：乳頭型7例；腺泡型53例；附壁型10例；微乳頭型1例；實體型30例。其中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移者31例。按照TNM分期（根據(jù)第7版肺癌TNM分期體系為標準）分為：Ⅰ期53例；Ⅱ期17例；Ⅲ期21例；Ⅳ期10例。

納入標準：①經(jīng)臨床查體、影像檢測、病理診斷確診為肺癌，并且行肺癌EGFR免疫組化的患者；②患者均簽署知情同意書；③臨床病理診斷由兩位經(jīng)驗豐富的醫(yī)師得出的結(jié)果；④年齡為25～80歲；⑤預(yù)期患者壽命＞1年。排除標準：①既往或現(xiàn)在心、肝、腎等重要臟器患有嚴重疾??；②患者本人或其家屬沒有良好的依從性，研究期間沒能積極配合者[2]。

1.2 方法

所有患者EGFR免疫組化的切片均進行人工計數(shù)與計算機圖像分析。

EGFR免疫組化染色人工計數(shù)方法：所有EGFR免疫組化的切片都由同一名資深病理科醫(yī)師審閱，在審閱過程中，該醫(yī)師對EGFR免疫組化切片的最初診斷、驅(qū)動基因情況和患者的病例信息都不知曉，審閱過程客觀且獨立進行。首先在低倍鏡視野下觀察切片的全貌，找到腫瘤細胞所在的區(qū)域后，切換至高倍鏡，隨機抽取5個高倍視野（×400），每個視野計數(shù)約100個肺癌細胞。

表1. 兩組定性結(jié)果的一致性比較(n=101)

EGFR免疫組化的圖像采集分析方式：采用圖像分析系統(tǒng),在低倍鏡視野下觀察切片的全貌，隨機選取個視野5個視野，作為空白對照。然后，將低倍鏡切換至高倍鏡后隨機抽取5個高倍視野（可較EGFR免疫組化染色人工計數(shù)方法的高倍視野略低）應(yīng)用計算機圖像分析軟件觀察分析抽取結(jié)果，可見暴露EGFR表達的棕黃色區(qū)域的面密度、平均光密度以及暴露肺癌腫瘤細胞核所在的藍色區(qū)域的面密度。通過染色比值=（棕色區(qū)域面密度÷藍色區(qū)域的面密度)×棕色平均光密度，空白對照的比值定義為閾值，根據(jù)陰性和陽性對照的顯色情況,在確定無假陽性和假陰性的前提下，圖像分析陽性結(jié)果為大于閾值的病例。

1.3 觀察指標與判定標準

①染色劑強度的評定標準：0分，未能著色；1分，著淡黃色，陽性細胞百分比≤10%；2分，著黃棕色，陽性細胞百分比＞10%，≤50%；3分，著棕褐色，陽性細胞百分比＞50%。根據(jù)癌細胞表達的染色強度×陽性細胞百分數(shù)計算出結(jié)果，當(dāng)?shù)梅帧?時記為陽性，＜3時記為陰性。②比較圖像分析定性結(jié)果與人工計數(shù)結(jié)果的一致率，當(dāng)Kappa值處于0.4～0.75，表示兩種方法無顯著差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

以SPSS22.0軟件包進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)由EXCEL 2010軟件核對無誤后再予處理。不同的臨床病理數(shù)據(jù)下，EGFR免疫組化的圖像采集分析的染色程度比值對比分析擬用Kruskal-Wallis秩和檢驗。臨床病理數(shù)據(jù)與EGFR蛋白表達的定性結(jié)果相關(guān)性比較擬用χ2檢驗，以上兩組經(jīng)過客觀對比后，若P＜0.05則二者存在較大差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組方法EGFR免疫組化的染色結(jié)果

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在高倍鏡（×400）下，EGFR蛋白表達大部分位于肺癌細胞膜上，胞漿偶見略淺的著色。圖像采集分析計算的染色程度的平均比值為0.137，按照空白對照的染色程度比值，定性結(jié)果為陽性72例（71.29%），陰性29例（28.71%），陽性率為71.29%；人工計數(shù)的染色程度平均比值為43.61，陽性15例（14.85%），陰性86例（85.15%）；對比人工計數(shù)較圖像分析染色程度平均比值顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 兩組方法定性結(jié)果分析

觀察可見，兩組方法的一致率為87.93%，Kappa值為0.71，處于0.4～0.75，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表1。

3.討論

隨著人們健康意識的提高，有關(guān)EGFR蛋白表達的研究成為肺癌研究的熱點話題之一。EGFR屬于I型生長因子家族,是一種受體性酪氨酸激酶，由胞外區(qū)（ECD）、疏水的跨膜區(qū)（TM）和胞內(nèi)區(qū)組成，當(dāng)EGFR蛋白高表達時對放化療產(chǎn)生抗拒，導(dǎo)致患者的預(yù)后不良，將引起組織癌變，促進腫瘤細胞生長或侵襲，形成新生血管和癌細胞遠處轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR的表達程度與患者的生存并無顯著相關(guān)，因此，不能將EGFR的表達作為評價患者預(yù)后的獨立因素。EGFR經(jīng)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運進入細胞核后，可作為共轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)基因的表達，活化后能夠與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)PLCT、P13K連接，受體類型和磷酸化結(jié)合位點不同，將激活相應(yīng)的信號蛋白。由于臨床不同的免疫組化方法之間存在較大差異，每種方法所致的陽性結(jié)果計數(shù)方法各不相同，若受到觀察者主觀判斷，評定結(jié)果會產(chǎn)生較大影響。其次，臨床各項病理數(shù)據(jù)能影響結(jié)果陽性率高低，如果單純用一個閾值判斷EGFR的陽性和陰性，容易導(dǎo)致統(tǒng)計數(shù)據(jù)計算、分析的結(jié)果產(chǎn)生變化。針對本次研究中，通過定量和定性結(jié)果分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計算得到的結(jié)果千差萬別。相比之下，定量研究能夠更加準確的體現(xiàn)EGFR的蛋白表達情況。計算機圖像分析是研究者對圖像進行準確定量的一種方式，實驗結(jié)果會被任何人為或者自然因素產(chǎn)生的誤差所改變。故此，在研究者進行免疫組化的染色操作時，應(yīng)時刻注意控制實驗變量，減少系統(tǒng)誤差，降低混合偏倚。在圖像進行采集的同時預(yù)設(shè)的參數(shù)有必要做到一致，以確保同一組樣本之間的可比性。本研究結(jié)果顯示，人工計數(shù)與圖像分析染色程度平均比值相比較高，說明EGFR免疫組化的陽性率低；通過人工計數(shù)與圖像分析定性結(jié)果分析，可得出兩種方法的一致率較高，但計算機圖像分析的準確性和客觀性更高。