強酸性電解質(zhì)水對饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的殺滅作用研究

趙春苗，程小剛 ，余擎

根管治療術(shù)存在一定的失敗率，這些病例的失敗主要是由于根管內(nèi)的細(xì)菌沒有被完全清除［1］。經(jīng)過根管治療的患牙根管系統(tǒng)的內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)大量減少，也就是說經(jīng)過治療的根管為細(xì)菌提供的是一個營養(yǎng)缺乏的環(huán)境［2］，這時候細(xì)菌通過自身的適應(yīng)性機制以饑餓的狀態(tài)來適應(yīng)新的環(huán)境［3］。Stuart CH等［4-6］對根管治療后發(fā)生再感染的病例進行細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，約24%～77%的根管中有糞腸球菌（enterococcus faecalis），它還可以長期饑餓生存并形成生物膜。

現(xiàn)有的應(yīng)用最多的根管沖洗劑是不同濃度的次氯酸鈉（NaClO）。Liu H等［7］的研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉對饑餓態(tài)的糞腸球菌生物膜有殺菌作用，所以本實驗選用次氯酸鈉作為陽性對照。PH值約為2.3～2.7的強酸性電解質(zhì)水（strong acid electrolytic water，SAEW）［8-9］，由于它的安全性和抗菌效果較好，從二十幾年前便被嘗試用作根管沖洗劑［10］。Cheng X等［11］的實驗結(jié)果表明SAEW能殺滅糞腸球菌，但SAEW能否殺滅饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜還需要研究。本實驗于2019年3—5月通過微生物學(xué)實驗觀察SAEW對饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的殺菌作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器糞腸球菌凍干株ATCC 29212（空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體實驗室）；腦心浸液培養(yǎng)基（BHI；Difco，MI，美國）；SAEW用專用的電解質(zhì)水生成裝置-電解質(zhì)水生成儀（Alfa Light；Amano Co.，日本）電解1 g/L的氯化鈉溶液陽極獲得；5.25%次氯酸鈉溶液（空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院）；Biofuge Stratos型臺式冷凍離心機（Kendro，USA）；24孔板（NUNCLON；Nunc，Roskilde，Denmark）；干燥機（ES-2030，Hitachi，日本）；離子濺鍍系統(tǒng)（Lon Sputter E-1045，Hitachi，日本）；掃描電子顯微鏡（SEM，S-4800，Hitachi，日本）。

1.2 糞腸球菌饑餓狀態(tài)誘導(dǎo)及饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的形成參考Heim等［12］的方法，將糞腸球菌（ATCC 29212）凍干菌株復(fù)蘇后培養(yǎng)4 h，獲得對數(shù)生長期的糞腸球菌菌液，細(xì)菌密度約為1.5×109CFU/mL。在4℃條件下，低溫離心機以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min獲取糞腸球菌沉淀，把沉淀溶于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液中，再低溫離心并溶于PBS中，重復(fù)兩次后溶于PBS溶液中，調(diào)節(jié)細(xì)菌密度為109CFU/mL。調(diào)節(jié)好密度的細(xì)菌懸液置于37℃恒溫箱中在厭氧避光的條件下培養(yǎng)48 h，獲得饑餓態(tài)糞腸球菌。

將11×11 mm2蓋玻片（已高溫高壓滅菌器滅菌）置于24孔板中。滴1 mL饑餓態(tài)糞腸球菌菌液。37℃厭氧靜止培養(yǎng)24 h后饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜形成。

1.3 不同沖洗劑對饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的殺菌作用觀察將饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜分成9組，每組20個樣本，分別用5.25%次氯酸鈉、SAEW以及0.9%氯化鈉溶液（NS）處理1、5和10 min。處理后用PH＝7的PBS緩沖液輕柔地洗去殘留的處理液。每組中的10個樣本用震蕩的方法得到處理后的樣本，將菌液涂布于BHI平板，37℃厭氧培養(yǎng)24 h后，用活菌計數(shù)法得到被處理后細(xì)菌存活率。

每組中另10個樣本在4℃條件下用2.5%戊二醛隔夜固定。固定后用50%、70%、80%和90%的乙腈進行梯度脫水，每個濃度脫水20 min；接著100%的乙腈脫水2次，每次20 min。然后用干燥機二氧化碳臨界點干燥，干燥后用離子濺鍍系統(tǒng)噴金，噴金以后SEM觀察［13］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，美國）對不同沖洗劑處理后細(xì)菌存活率xˉ±s進行方差分析。同一組別不同時間點比較以及同一時間點三組比較，用方差分析中的SNK-q檢驗進行兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同沖洗劑處理后活菌計數(shù)結(jié)果如表1所示，同一沖洗液1、5、10 min不同時間組之間進行組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)SAEW和5.25%次氯酸鈉各時間組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），也就是說SAEW和5.25%次氯酸鈉對饑餓態(tài)糞腸球菌有殺滅作用，且處理1 min時的效果最弱，處理5 min時殺菌效果增強，處理10 min時的殺菌效果最強。同一時間不同沖洗液組間比較發(fā)現(xiàn)，SAEW和5.25%次氯酸鈉都有一定的殺菌作用，且殺滅效果都比NS組強（P＜0.05），同時5.25%次氯酸鈉處理1 min和5 min時對饑餓態(tài)糞腸球菌的殺滅作用比SAEW的作用強（P＜0.05）；但是處理10 min組時兩組的殺滅作用接近（P＞0.05）。說明SAEW對饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜有有效的殺滅作用，且處理10 min的殺菌效果接近5.25%次氯酸鈉處理10 min的殺菌效果。

表1 不同沖洗液處理后的細(xì)菌存活率/（%，xˉ±s）

2.2 SEM觀察的結(jié)果SEM觀察結(jié)果顯示（圖1，2），饑餓態(tài)的糞腸球菌生物膜由皺縮失水的細(xì)菌細(xì)胞形成，細(xì)菌細(xì)胞表面凹凸不平、均一性較差。隨著NS處理時間的延長細(xì)菌細(xì)胞皺縮失水現(xiàn)象加重；SAEW和5.25%次氯酸鈉處理后不僅有嚴(yán)重的皺縮失水現(xiàn)象，還出現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞的溶解和破壞、細(xì)胞膜表面有穿孔和碎片樣改變，而且隨著處理時間的延長細(xì)菌細(xì)胞的破壞更加嚴(yán)重。這提示SAEW和5.25%次氯酸鈉可能具備對饑餓態(tài)的糞腸球菌生物膜相似的殺滅機制。

圖1 未處理的饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜掃描電子顯微鏡圖片（×50 000）

3 討論

根管治療術(shù)是臨床治療牙髓、根尖周病的常用手段［14］。Sun J等［15］的研究表明，在根管治療失敗的病例中糞腸球菌是主要的致病菌。經(jīng)過嚴(yán)密的充填，根管內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、氧氣稀少，這時候根管內(nèi)沒有被清理和殺滅的細(xì)菌微生物就會以饑餓的狀態(tài)生存［16-17］。糞腸球菌有一種長時間耐受饑餓的能力，只要環(huán)境中出現(xiàn)能被它利用的養(yǎng)分，它就可以很快吸收養(yǎng)分恢復(fù)活性并造成根管系統(tǒng)的再次感染［18］。

現(xiàn)代觀點認(rèn)為，在根管治療過程中根管系統(tǒng)有沒有有效地清理是治療是否成功的重要步驟；通過機械預(yù)備清理根管內(nèi)的感染物質(zhì)、化學(xué)沖洗作用對根管進行清洗消毒，兩者結(jié)合以達到有效清理根管的目的［19］?，F(xiàn)在常用的根管沖洗劑次氯酸鈉是應(yīng)用的最多的沖洗劑［20］。Siqueira等［21］的研究表明，只要根管治療過程用次氯酸鈉進行根管沖洗，糞腸球菌的檢出率就顯會著降低。但是次氯酸鈉作為根管沖洗劑其殺菌的最佳濃度、溫度、作用時間等都不確定［20，22］。而且次氯酸鈉沖洗后牙本質(zhì)的膠原纖維會被去除，從而降低牙本質(zhì)的粘接性能［23］。此外，較高濃度的次氯酸鈉有一定的細(xì)胞毒性和刺激性作用，可能會造成根尖周組織的損傷［24-26］。次氯酸鈉還可能會引起病人的過敏反應(yīng)［27］。所以次氯酸鈉雖然應(yīng)用廣泛但并不是最理想的。Cheng X等［11］的實驗發(fā)現(xiàn)SAEW安全性好且對糞腸球菌（非饑餓態(tài)）有殺滅作用，本研究就在原有研究的基礎(chǔ)上研究SAEW對饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的殺菌作用。

本研究的活菌計數(shù)法實驗表明，SAEW對饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜具有有效的殺滅作用，且作用10 min的殺菌效果和5.25%次氯酸鈉作用10 min的殺菌效果接近。SEM實驗表明，SAEW和5.25%次氯酸鈉處理饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜后，細(xì)菌細(xì)胞皺縮失水現(xiàn)象加重，此外有的細(xì)胞發(fā)生溶解、破壞，細(xì)胞膜表面有穿孔和碎片樣改變，而且這種變化隨著處理時間地延長而更加明顯。研究表明，未解離的次氯酸是次氯酸鈉主要的殺菌成分［21］。次氯酸、氯氣、過氧化氫以及氫氧根離子的共同作用使SAEW有一定的殺菌作用［11］。相似的酸性成分使次氯酸鈉和SAEW處理后有相似的細(xì)菌形態(tài)的變化。

圖2 處理后的饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜掃描電子顯微鏡圖片（×50 000）

綜上，SAEW對饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜有有效的殺滅作用，且殺菌效果與5.25%次氯酸鈉的殺菌效果接近，殺菌機制也類似。聯(lián)合以往研究，SAEW對多種微生物有殺滅作用［28］。此外，SAEW在根管沖洗過程中還可以去除根管玷污層、對根尖周組織的細(xì)胞毒性低、使用后還原成水不會對環(huán)境造成污染等優(yōu)點［28-30］。因此可以考慮用SAEW作為根管沖洗劑替代5.25%次氯酸鈉，但是目前還沒有實驗證明SAEW具有組織溶解性，所以SAEW作為根管沖洗劑還需要進一步的研究。