十二指腸乳頭區(qū)精細注射法誘導大鼠急性重癥胰腺炎模型

劉璐璐，唐敏，宋莎莎，江威，徐詩霞，黃山，陳治東，章禮久

急性重癥胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）的特殊類型，是一種進展快、并發(fā)癥多、病死率高的急腹癥［1-2］，占AP的10%～20%。目前對該病的發(fā)病機制和病變過程缺乏深入認識。因此，選擇合適的SAP建模方法對研究SAP具有深遠意義。查閱國內(nèi)外文獻，建立AP模型的方法主要包括侵襲性和非侵襲性操作［3-4］，其中侵襲性操作有逆行胰膽管注射法［5］、直接胰管結扎術法［6］、微泵注入法［7］及胰腺被膜下注射等。直接胰管結扎和微泵注入等方法對手術器械條件及術者的手術技能要求極高，操作難度極大，不利于推廣。胰腺被膜下注射法為胰腺被膜下打針法［8］改良設計。非侵襲性操作包括：L-精氨酸（L-Arginine）注射法［9-10］、雨蛙素注射法［11-12］、無膽鹽乙硫氨酸（CDE）［13］喂養(yǎng)法等，但都適用于誘導輕型胰腺炎動物模型。除了上述造模方法，還有胰腺直接損傷法［14］，Harisa GI等［15］報道的大鼠尾靜脈注射泰洛沙泊（Tyloxapol）的高脂血癥性AP方法。而另有電針刺激法、高鈣血癥法、動脈注射微球法、免疫介導法以及不同方法聯(lián)合應用等多種類型［16］的AP動物模型建立方法。但臨床上最常見的胰腺炎類型為膽源性胰腺炎。本研究主要為模擬膽源性胰腺炎機理，建立對手術器械條件要求不高、操作時間短、可重復性強、穩(wěn)定性好、死亡率低的SAP動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠75只，雄性，體質(zhì)量范圍為200～250 g，購于北京維通利華公司，6周，醫(yī)學實驗動物合格證號：170018，醫(yī)學實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。適應性飼養(yǎng)1周，簡單隨機化分組法分為五組：假手術組、精細注射組6 h、精細注射組24 h、被膜下組6 h、被膜下組24 h，每組15只。

1.1.2 實驗藥品 在胰島素筆中注入牛磺膽酸鈉（5 g/100 mL滅菌水，5%）。配制好的5%?；悄懰徕c裝入自制的胰島素筆的3 mL針管中，每0.1毫升換算10個單位，按照0.1 mL/100 g進行總量計算，根據(jù)大鼠體質(zhì)量計算胰島素筆的注射量，準備試驗器械及背景燈光。

1.2 實驗方法

1.2.1 麻醉方法 腹腔注射10%水合氯醛（10 g水合氯醛，用無菌水配置成10%濃度的液體，4℃保存），按1 mL/100 g劑量麻醉。

1.2.2 手術方法 手術臺上，大鼠給予備皮，消毒。精細注射法：仰臥固定，從腹部正中口切開約2 cm，逐層分離，將十二指腸輕輕提起，背景燈光照射下沿著腸系膜下方找出膽胰管口，用血管鉗輕輕夾閉開口上下約5 mm處，在膽管距腸壁15 mm處用鑷子輕輕夾住。用胰島素筆連接BD針頭避開血管，斜向穿刺腸壁至十二指腸乳頭區(qū)，在胰膽管開口處，朝向膽管方向，深入2～3 mm，以0.1 mL/min的速度緩慢逆行注射入膽管內(nèi)，待胰腺變色、水腫時結束手術，關閉腹腔（圖1）。被膜下法：腹壁正中切口入腹，尋找胰腺組織及被膜，用胰島素筆將所需體積的牛磺膽酸鈉分次多部位注射入被膜下。假手術組：行開腹手術，開腹后翻動胃腸即關腹。上述操作僅行1次。

1.2.3 術前和術后管理 大鼠實驗前12 h禁食不禁水。術后使用燈光照射，選用側臥位或仰臥位，觀察大鼠術后呼吸運動情況，必要時給予更換體位或心肺復蘇。

1.2.4 血清學檢測 各組大鼠分別于造模后6 h、24 h處死，頸動脈穿刺采血，離心機4 000 r/min離心10 min，取上層清夜置于-20℃冰箱凍存，根據(jù)試劑盒說明書檢測各組血清淀粉酶含量。

1.2.5 胰腺組織病理學檢查 將實驗大鼠分別在造模后6 h、24 h處死，取胰腺，選取胰腺多部位組織用4%多聚甲醛溶液固定2 h，常規(guī)制成4 m的石蠟組織切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察胰腺組織病理學改變，并根據(jù)Kusske標準對組織切片進行評分。

1.2.6 成模率統(tǒng)計 SAP診斷的金標準為組織病理，需同時可見組織明顯水腫、炎癥細胞浸潤及出血壞死表現(xiàn)，以此來統(tǒng)計各組大鼠成模率。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用xˉ±s描述，各組間整體比較采用單因素方差分析、多重比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)及率表示，比較采用χ2檢驗（整體+分割χ2檢驗）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠死亡率比較假手術組大鼠均存活，死亡率為0%（0/15）。30只精細注射組大鼠均存活，死亡率為0%（0/30）。被膜下組有兩只大鼠在造模過程中因穿刺胰腺血管導致出血性休克而死亡，死亡率6.67%（2/30）。組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 手術時間比較手術時間數(shù)據(jù)列于下表1。被膜下組較精細注射組手術時間明顯縮短（P＜0.05）。

表1 各組手術時間比較

2.3 各組血清淀粉酶比較如表2所示，整體比較（單因素方差分析）可知：整體差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。多重比較并結合主要數(shù)據(jù)分析：與假手術組比較，其余各組血清淀粉酶含量均顯著升高（P＜0.05）；精細注射組24 h較精細注射組6 h血清淀粉酶含量明顯升高，且較被膜下組6 h也顯著升高（P＜0.05）。

2.4 胰腺組織病理學變化造模結束后，光鏡下觀察胰腺組織病理并進行胰腺炎嚴重程度評分?？梢姡▓D2）：精細注射組6 h與被膜下組6 h的胰腺細胞水腫、炎癥細胞浸潤、出血、壞死改變不明顯。被膜下組24 h可見明顯炎癥細胞浸潤、水腫以及少量的出血壞死表現(xiàn)。精細注射組24 h可見廣泛凝固性壞死伴出血，壞死區(qū)細胞結構不清，實質(zhì)內(nèi)大量炎癥細胞浸潤。

參考胰腺炎Kusske評分標準對以上病理圖片進行評分，結果如表2所示，整體比較（單因素方差分析）可知：整體差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。多重比較并結合主要數(shù)據(jù)分析：與假手術組比較，其余各組胰腺炎病理評分均顯著升高（P＜0.05）；與6 h比較，24 h的胰腺炎病理評分明顯升高（P＜0.05）；與被膜下組24 h比較，精細注射組24 h的胰腺炎病理評分明顯升高（P＜0.05）。

表2 各組血清淀粉酶、胰腺炎病理評分比較/xˉ±s

2.5 各組成模率比較如表3所示，整體比較（χ2檢驗）可知：整體差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。多重比較并結合主要數(shù)據(jù)分析：假手術組、被膜下組6 h和精細注射組6 h均無成模大鼠。精細注射組24 h較被膜下組24 h的成模率明顯升高（P＜0.05）。

表3 各組成模率比較

3 討論

牛磺膽酸鈉是人體內(nèi)2種膽汁酸的主要成分之一，選用牛磺膽酸鈉可模擬膽總管下段梗阻時膽汁酸反流引起的AP［17-18］。

在預實驗中，實驗大鼠選擇戊巴比妥鈉進行麻醉，但發(fā)現(xiàn)術后大鼠多出現(xiàn)逐漸呼吸衰竭而死亡，死亡率極高。后選擇水合氯醛麻醉后大鼠死亡率明顯降低，在實驗過程中無大鼠死于麻醉。

大鼠SAP模型誘導方法主要包括逆行胰膽管注射法和被膜下多點注射法。本研究發(fā)現(xiàn)被膜下多點注射牛磺膽酸鈉法較逆行胰膽管注射法時間較短。但由于胰腺組織供血豐富，被膜下血管分布密集，多點注射時易導致出血，且血管較細，難以用止血鉗止血，實驗過程中兩只大鼠均因失血性休克死亡，故手術操作風險及難度較大。逆行胰膽管注射法大多具有重復性好、模型穩(wěn)定的優(yōu)點，病理改變存在劑量依賴性與時間依賴性，但此類方法均需通過顯微鏡反復精確調(diào)整角度，對膽管進行切開或穿刺置管，因膽管纖細，手術難度極大。且胰膽管隔著十二指腸腸壁，腸壁血管豐富，易發(fā)生失血性休克。

本研究對逆行胰膽管注射法進行改良，首次采用十二指腸乳頭區(qū)精細注射法，使用胰島素筆注入?；悄懰徕c的方式控制給藥劑量和速度。選擇對十二指腸乳頭朝向膽管開口的部位精細注射，保證一部分?；悄懰徕c進入膽管，同時乳頭水腫，避開十二指腸管壁血管，誘導SAP。此種方法無須進行膽管切開或?qū)δ懝苓M行穿刺置管，對膽管損傷小，基本無出血，操作難度顯著降低。實驗結果發(fā)現(xiàn)，十二指腸乳頭區(qū)精細注射法與被膜下多點注射法相比較，手術時間稍長，但無死亡大鼠，誘導的模型大鼠血清淀粉酶含量升高顯著，且呈進行性升高。精細注射法胰腺組織病理可見廣泛凝固性壞死伴出血，壞死區(qū)細胞結構不清，實質(zhì)內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，且根據(jù)Kusske標準，胰腺組織病理評分顯著高于被膜下組。綜上，十二指腸乳頭區(qū)精細注射法具有成模率高、病理典型、與臨床SAP狀態(tài)相符的特點。

十二指腸乳頭區(qū)精細注射法需要實驗者掌握一定的外科手術技能，具備相應的解剖學知識。操作過程需在背景燈光照射下，避開十二指腸腸壁血管，正確識別膽管、胰管，找到膽胰管共同開口處，朝向膽管開口方向，注射速度要緩慢且均勻。（本文圖1，2見插圖12-1）

圖1 牛磺膽酸鈉十二指腸乳頭區(qū)精細注射法示意

圖2 各組胰腺組織病理圖片（HE染色×400）：A為假手術組；B為被膜下組6 h；C為被膜下組24 h；D為精細注射組6 h；E為精細注射組24 h