高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定女金膠囊等四種中成藥中橙皮苷和丹皮酚的含量

李燕，同曉霞，楊曉莉

女金膠囊、調(diào)經(jīng)丸、舒爾經(jīng)顆粒、活血止痛膏等中藥成方制劑，具有祛寒止痛、活血通絡(luò)、理氣止痛等功效。這幾種中成藥中均含有陳皮和牡丹皮成分，陳皮為蕓香科植物，其性溫、味苦等，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效，橙皮苷為中藥陳皮藥材中的有效成分［1-3］；牡丹皮具有清熱涼血、活血散瘀的功效，具有保肝護(hù)腎、鎮(zhèn)靜、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛等多重藥理作用，丹皮酚為中藥材牡丹皮中的有效成分［4-6］。由于這幾種中成藥使用范圍較廣，所含藥味繁多，一直難以建立橙皮苷和丹皮酚含量測(cè)定的方法［7-16］。為更好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保障人民群眾的用藥安全與有效，本研究于2017年6—10月建立一種利用高效液相色譜儀，以橙皮苷和丹皮酚為檢測(cè)指標(biāo)，定量測(cè)定上述中成藥中橙皮苷和丹皮酚的含量的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器高效液相色譜儀：安捷倫1200主機(jī)（安捷倫科技有限公司）；檢測(cè)器：G4212A多波長(zhǎng)檢測(cè)器（美國agilent）；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 m）（安捷倫科技有限公司）；電子天平：梅特勒XS205DU（梅特勒科技有限公司）；數(shù)控超聲波清洗機(jī)：SK3300LH型（廣州滬瑞明儀器有限公司）；渦旋混合器：T25，3 000～18 000 r/min（廣州IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)：H2100R型（湘儀離心機(jī)公司）；純水儀：Milli-Q（密理博科技有限公司）。

1.2 材料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：橙皮苷（含量96.1%，批號(hào)110721—201617，中國食品藥品檢定研究院）；丹皮酚（含量99.9%，批號(hào)110708—201407，中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 試劑甲醇：色譜純（德國默克公司）；磷酸：分析純（國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司）；純化水：自制。

1.4 色譜參數(shù)Agilent ZORBAX SB-C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 m）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 L；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.2%磷酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：279 nm；掃描波長(zhǎng)：190～400 nm。梯度洗脫設(shè)置見表1。

表1 梯度洗脫設(shè)置

1.5 溶液制備對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液：取橙皮苷和丹皮酚對(duì)照品各約25 mg，精密稱定，置于同一個(gè)25 mL量瓶中，加甲醇約15 mL溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻（橙皮苷和丹皮酚質(zhì)量濃度均為：1.0 μg/mL）。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：取對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液適量，制成濃度分別為0.2、0.4、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻。

供試品溶液：取中成藥（以女金膠囊為例），取供試品10粒，分別精密稱定重量，傾出內(nèi)容物，計(jì)算裝量差異；取裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物，研缽研成細(xì)粉，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇約30 mL，超聲提取約20 min；放置至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻；取上述溶液，0.45 m濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取橙皮苷對(duì)照品一定量，配制含有橙皮苷質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同法配制丹皮酚5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，橙皮苷在（274±2）nm范圍內(nèi)有最大吸收；丹皮酚在（284±2）nm范圍內(nèi)有最大吸收。為提高橙皮苷和丹皮酚檢測(cè)靈敏度，故選擇279 nm作為色譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的選擇試驗(yàn)分別選擇0.2%磷酸溶液與甲醇體系和0.2%磷酸溶液與乙腈體系對(duì)橙皮苷和丹皮酚進(jìn)行洗脫。試驗(yàn)證明，選擇乙腈體系時(shí)，橙皮苷出峰速度較快，出峰時(shí)間在4.21 min，但基質(zhì)干擾較嚴(yán)重，定量結(jié)果不準(zhǔn)確；選擇甲醇體系時(shí)，橙皮苷和丹皮酚能夠較好的分離，且甲醇相對(duì)于乙腈對(duì)試驗(yàn)人員及環(huán)境的影響更小，故試驗(yàn)選擇0.2%磷酸溶液與甲醇體系作為流動(dòng)相，典型譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察取對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液適量，制成濃度分別為0.2、0.4、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻；取上述溶液分別進(jìn)樣分析，以各對(duì)照品溶液的濃度（X）與其對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）做線性擬合曲線，結(jié)果橙皮苷和丹皮酚在0.2～20.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系；取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋至各對(duì)照品色譜峰峰高分別達(dá)到3倍信噪比，計(jì)算檢出限。結(jié)果見表2。

圖1 以0.2%磷酸溶液與甲醇體系作為流動(dòng)相測(cè)定橙皮苷和丹皮酚含量的高效液相典型譜圖

表2 曲線方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 回收率試驗(yàn)取已知含量的供試品樣品，精密稱取約0.2 g，分別加入適量的對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液，配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3份，按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，橙皮苷回收率在92.6%～100.9%之間；丹皮酚回收率在90.6%～98.2%之間。結(jié)果見表3。

2.5 精密度考察取供試品樣品，按1.5供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，得到供試品溶液。按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析。同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明，橙皮苷測(cè)定結(jié)果精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%；丹皮酚測(cè)定結(jié)果精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.11%。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性與穩(wěn)定性取供試品樣品，按1.5供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，得到供試品溶液。同法配制6份供試品溶液。按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，橙皮苷測(cè)定結(jié)果重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.14%；丹皮酚測(cè)定結(jié)果重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.76%；再取重復(fù)性溶液1份，室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析。測(cè)得橙皮苷和丹皮酚的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.51%和2.71%，結(jié)果表明，在此試驗(yàn)條件下，供試品溶液能夠穩(wěn)定放置24 h。

2.7 方法應(yīng)用實(shí)例《中國藥典》2015年版中，女金膠囊、調(diào)經(jīng)丸、舒爾經(jīng)顆粒、活血止痛膏均未建立橙皮苷［17］191和丹皮酚［17］172的含量測(cè)定方法，采用藥典方法檢測(cè)陳皮和牡丹皮中橙皮苷和丹皮酚時(shí)，需要分開配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，檢測(cè)效率偏低、溶劑用量大、環(huán)境友好度低。取上述四種中成藥樣品，按1.5供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，得到供試品溶液；按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析，測(cè)定橙皮苷和丹皮酚的含量；同時(shí)參照《中國藥典》2015年版一部中陳皮和牡丹皮中橙皮苷和丹皮酚測(cè)定方法，對(duì)上述中成藥進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法可同時(shí)測(cè)定橙皮苷和丹皮酚的含量，檢測(cè)結(jié)果與藥典基本一致。結(jié)果見表4。

表4 樣品檢測(cè)結(jié)果/%

3 討論

本試驗(yàn)研究建立一種利用高效液相色譜法檢測(cè)女金膠囊等四種中成藥中橙皮苷和丹皮酚定量檢測(cè)的方法。首先對(duì)試驗(yàn)的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化：優(yōu)化了檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相體系；考察了方法的線性曲線、回收率、檢出限、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等，結(jié)果表明，該方法適用于女金膠囊等四種中成藥中橙皮苷和丹皮酚含量的檢測(cè)，對(duì)制假、售假中成藥等不法商販形成威懾，為國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)制定和中成藥風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)依據(jù)。試驗(yàn)證明，該方法具有前處理簡(jiǎn)單、檢出限低、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，可以用于上述女金膠囊等四種中成藥的質(zhì)量控制。