一測(cè)多評(píng)法測(cè)定槐花中3種黃酮類成分的含量

黃和軍，崔小兵，楊軍輝

中藥槐花為豆科植物槐Sophora japonica L.的花蕾及干燥花，花蕾稱為“槐米”，干燥花稱為“槐花”。槐花主要功效為涼血止血，清肝瀉火［1］，屬于藥食兩用的中藥［2-3］?；被ê悬S酮、皂苷、多糖等化學(xué)成分，另外還含有少量鞣質(zhì)，其中黃酮類化合物占比較大［4］。蘆丁是其主要黃酮類活性成分，其在酶或酸的作用下會(huì)水解成槲皮素［5］。現(xiàn)代藥理研究表明槐花具有降血糖［6-8］、抗菌［9］、抗氧化［10］、止血［11-12］、增強(qiáng)免疫力［13-14］、清熱涼血［15］、保護(hù)腸胃［16］等多種作用。

2015版藥典中僅有槐花中蘆丁的高效液相含量測(cè)定，并未見(jiàn)同時(shí)對(duì)槐花中多個(gè)成分含量測(cè)定的研究報(bào)道。本課題組前期已對(duì)槐花提取物發(fā)表過(guò)相關(guān)文章［17］，本研究以蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素為指標(biāo)成分對(duì)槐花進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。但多指標(biāo)評(píng)價(jià)常導(dǎo)致對(duì)照品消耗量大，因此引入一測(cè)多評(píng)法（QAMS）的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式?；谝陨?，本研究于2008年10月至2015年12月以蘆丁作為內(nèi)標(biāo)物，分別計(jì)算蘆丁與槲皮素和山柰酚-3-O-蕓香糖苷的相對(duì)校正因子，并采用QAMS和外標(biāo)法測(cè)定40批槐花藥材中蘆丁，山柰酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素的含量，比較兩種測(cè)定方法之間的差異，旨在為槐花藥材的質(zhì)量控制提供新方法。

1 儀器與試劑

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Shimadzu 10A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；AY220 1/萬(wàn)電子分析天平；TGL 16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MUL-9000 Series超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；FW100型萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；HH-S恒溫水浴鍋（江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2試劑蘆丁對(duì)照品（批號(hào)F20060526，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品（批號(hào)WJ0322KA13，上海源葉生物科技有限公司）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)YA0806YB13，上海源葉生物科技有限公司）。40批生槐花批號(hào)依次為江蘇131121，河北3050501，安徽140510，安徽20140601，江 蘇 111018，河 北 140726，山 東 140323，安 徽140601，河南140401，河北140726，安徽140406，安徽 140504，山西 140409，國(guó)槐河北 140426，山東140402，山東140402，山東140625，湖北140524，河北304221，山東140512，安徽131203，安徽140602，安徽140408，江蘇141015，江蘇 141028江蘇，141030，河北304308，河北304310，河北304314，安徽 20140518，安徽 20140601，山東 140412，山東140625，山東140408，山東140629，安徽131210，安徽140608，安徽140413，湖北140526，湖北140528，河南140403，河南140411。甲酸（色譜純，批號(hào)607-001-00-0；德國(guó)Merck公司），甲醇（色譜純，批號(hào)2014051033，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品粉末：18.03 mg；槲皮素對(duì)照品粉末：2.13 mg；山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品溶液：2.5 mL（0.21 mg/mL），用70%甲醇定容于5 mL的容量瓶，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備取槐花藥材粉末0.5 g；精密稱定，置于50 mL容量瓶，采用70%甲醇超聲提取30 min，離心10 min（14 000 r/min）取上清液，作為供試品溶液。

2.3色譜條件儀器：Waters 2695液相色譜系統(tǒng)；色譜柱：Inertsil? ODS-SP（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：0.5%甲酸（B）∶甲醇（A）＝60∶40；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm?；旌蠈?duì)照品、樣品高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜法測(cè)定3種黃酮類成分的色譜圖：A為混合對(duì)照品，B為樣品

2.4方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 移取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1 mL，依次稀釋2倍，記作混標(biāo)2、混標(biāo)3、混標(biāo)4、混標(biāo)5，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積為Y軸，濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.2 精密度考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別計(jì)算3種成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果3種成分峰面積RSD分別為0.91%，1.31%，0.97%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性考察 取同一批槐花藥材（安徽131203）0.5 g，精密稱定6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算得到蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素含量及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 高效液相色譜法測(cè)定槐花3種黃酮類成分的重復(fù)性考察/（mg/g）

結(jié)果表明：蘆丁、山柰酚-3-O蕓香糖苷、槲皮素的RSD分別為1.83%、1.84%、1.69%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 稱取槐花（安徽131203）0.5 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣，計(jì)算蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素含量及RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 高效液相色譜法測(cè)定槐花3種黃酮類成分的穩(wěn)定性考察/（mg/g）

結(jié)果表明：蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素含量的RSD分別為0.68%、0.76%、0.70%，表明槐花藥材12 h的穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率考察 稱取6份已知含量的槐花藥材（安徽131203，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素含量分別為87.31 mg/g、2.29 mg/g、9.31 mg/g）0.25 g，分別按照含量的80%，100%，120%加入對(duì)照品溶液（蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素含量分別為2.18 mg/mL、0.055 mg/mL、0.24 mg/mL）8 mL、10 mL、12 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

其中蘆丁回收率的范圍為100.66%～104.77%、山柰酚-3-O-蕓香糖苷回收率的范圍為95.57%～104.47%、槲皮素回收率的范圍為95.28%～104.66%，RSD小于3.00%。

2.5 相對(duì)校正因子的建立以蘆丁作為內(nèi)標(biāo)物，取蘆丁對(duì)照品進(jìn)樣得到相應(yīng)的峰面積記作AS；對(duì)照品的濃度記作CS；校正因子f＝A/AS×CS/C，C＝f×A×CS/AS（其中A為被測(cè)物質(zhì)的峰面積，C為被測(cè)物質(zhì)濃度）。

2.5.1 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察 取槐花藥材（安徽131203）按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。同時(shí)采用蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素的對(duì)照品進(jìn)行進(jìn)樣比較。其中對(duì)照品的含量分別為蘆丁0.936 mg/mL；山柰酚-3-O-蕓香糖苷0.055 mg/mL；槲皮素0.140 mg/mL?？疾觳煌印⒉煌鶞?、不同流速、不同流動(dòng)相比例、不同儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果見(jiàn)表5。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同柱子、不同柱溫、不同流速、不同流動(dòng)相比例、不同儀器對(duì)山柰酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素的相對(duì)校正因子影響不大，RSD＜5%。

表5 不同柱子、柱溫、流速、流動(dòng)相比例、不同儀器下的校正因子及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

表1 高效液相色譜法測(cè)定3種黃酮類樣品的線性關(guān)系

表4 高效液相色譜法測(cè)定槐花3種黃酮類成分的加樣回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）/%

2.5.2 待測(cè)成分色譜峰定位以蘆丁作為內(nèi)標(biāo)物，利用相對(duì)保留時(shí)間和化合物的紫外吸收特征峰定位色譜峰，考察不同柱子、不同柱溫、不同流速、不同流動(dòng)相比、不同儀器對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響。結(jié)果見(jiàn)表6，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同柱子、不同柱溫、不同流速、不同流動(dòng)相比例、不同儀器對(duì)相對(duì)保留時(shí)間影響較小，RSD＜5%。

表6 不同柱子、柱溫、流速、流動(dòng)相比、不同儀器校下的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

測(cè)定結(jié)果：校正因子f＝A/AS×CS/C，樣品含量＝f×A×CS/AS。山柰酚-3-O-蕓香糖苷相對(duì)保留時(shí)間在1.5左右，相對(duì)校正因子f槲皮素/蘆?。?.513 4；槲皮素相對(duì)保留時(shí)間在2.6左右，相對(duì)校正因子f山柰酚-3-0-蕓香糖苷/蘆?。?.829 2，以此相對(duì)校正因子計(jì)算含量。

2.6 外標(biāo)法與QAMS測(cè)定的比較取40批槐花藥材按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。分別采用QAMS與外標(biāo)法計(jì)算40批槐花樣品中蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素含量，結(jié)果表明40批槐花樣品中3種黃酮用外標(biāo)法測(cè)得的總量為（10.08±1.38）%，其中最低為7.14%，最高為13.97%；用QAMS相對(duì)校正因子測(cè)得的總量為（9.98±1.39）%，其中最低為7.01%，最高為13.88%，結(jié)果見(jiàn)表7。采用SPSS 16.0軟件，對(duì)外標(biāo)法和QAMS所測(cè)的槐花中蘆丁、槲皮素和山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表8，兩種方法測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.324，P＝0.747）。

表7 40批槐花藥材外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法（QAMS）測(cè)定結(jié)果/%

3 討論

（1）本試驗(yàn)前期分別以30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇4種溶劑進(jìn)行超聲、回流、同時(shí)考察不同的提取時(shí)間、提取溶劑的體積，發(fā)現(xiàn)0.5 g槐花樣品加入70%甲醇50 mL超聲提取30 min，可獲得比較好的效果；用甲醇-甲酸水溶液作為流動(dòng)相體系，考察不同的流動(dòng)相比例，以及不同甲酸濃度對(duì)分離效果的影響。經(jīng)綜合考察基線噪聲、拖尾、分離度等因素的影響，最終采用流動(dòng)相比為40∶60；甲酸濃度為0.5%作為槐花含量測(cè)定的色譜條件。

（2）本研究分別考察了不同色譜柱、不同儀器下3種黃酮類成分色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示各成分與蘆丁內(nèi)參物的相對(duì)保留時(shí)間變化較小。因此采用相對(duì)保留時(shí)間法進(jìn)行槐花藥材中各待測(cè)組分色譜峰的定位較為可靠。

（3）本試驗(yàn)以全國(guó)主產(chǎn)地40批槐花藥材為研究樣本，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證、方法的耐用性試驗(yàn)、系統(tǒng)適用性等考察，對(duì)QAMS的適用性和實(shí)際應(yīng)用可行性進(jìn)行了比較研究。再采用SPSS 16.0軟件，對(duì)外標(biāo)法和QAMS所測(cè)的槐花中蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素含量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果P＝0.747，大于0.05，表明采用QAMS計(jì)算出的含量和外標(biāo)法所測(cè)得的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示本研究建立的校正因子可靠，能夠?qū)崿F(xiàn)在槲皮素和山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品缺乏的情況下，通過(guò)蘆丁與槲皮素和山柰酚-3-O-蕓香糖苷之間相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行色譜峰定性，利用蘆丁和校正因子計(jì)算槲皮素和山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量。由于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部“槐花”藥材含量測(cè)定項(xiàng)下只測(cè)定蘆丁的含量，本次試驗(yàn)所用槐花藥材樣本來(lái)源較廣，可以認(rèn)為此次采集的樣本基本上可以反映全國(guó)主產(chǎn)地槐花藥材的原始質(zhì)量狀態(tài)。因此本試驗(yàn)研究建立的QAMS含量測(cè)定方法可以作為槐花藥材國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂的重要參考依據(jù)。