不同月齡階段關(guān)嶺牛MYH3和MYH4基因mRNA表達(dá)水平的研究

覃 海 楊沛方 陳 偉 許厚強(qiáng) 陳 祥 周 萍 秦 媛 范 瑞

高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽550025；

關(guān)嶺牛因其主要產(chǎn)區(qū)在關(guān)嶺自治縣而得名，與陜西秦川牛、山西晉南牛、山東魯西牛和東北地區(qū)延邊牛并稱“中國五大名?！?，其主要的集中區(qū)域是盤江流域附近，同時(shí)關(guān)嶺牛也是屬于國家級(jí)別的重點(diǎn)保護(hù)畜禽之一。對于關(guān)嶺牛而言，其擁有的5個(gè)特質(zhì)主要是：擁有較高的出肉率且脂肪含量低、蛋白質(zhì)和氨基酸含量高，同時(shí)繁殖率和屠宰率較高，以眾多優(yōu)點(diǎn)被評(píng)為貴州省地方性優(yōu)良品種，塑造了“一生鮮草、一碗好肉”的良好品牌形象。

對于動(dòng)物肌肉而言，其主要的成分蛋白是肌球蛋白。肌球蛋白在總體蛋白的比例為15%～25%，是一種非常保守的蛋白。在肌肉收縮、物質(zhì)的運(yùn)輸工作等生理活動(dòng)中均發(fā)現(xiàn)了肌球蛋白[1]。在分子結(jié)構(gòu)水平上脊椎動(dòng)物的肌球蛋白長度約為160 nm，同時(shí)還表現(xiàn)出了如同字母“Y”的形狀，但并非對稱結(jié)構(gòu)[2]。肌球蛋白重鏈及輕鏈共同組成了肌球蛋白，也就是MYH 以及MLC，在這當(dāng)中有2 條重鏈，分子質(zhì)量在220 kμ 左右，而其中有4 條是輕鏈，分子質(zhì)量在16～20 kμ 之間[3]。MYH 有850個(gè)氨基酸殘基存在于N 端，并共同組成了球形頭部，而MYH的尾部由C 端構(gòu)成[4]。如果對球形頭部進(jìn)行劃分，可大體上劃分為3個(gè)主要功能區(qū)間，ATP的結(jié)合點(diǎn)在N 端的23 K，ATP 酶活性的激發(fā)是由第88個(gè)氨基酸所控制[5]，掌握肌肉收縮的是50K 區(qū)域，而肌動(dòng)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)是50K 區(qū)域。對于肌肉分化有主要影響的結(jié)構(gòu)基因是MYH基因[6]。

MYH基因是控制肌肉發(fā)生分化的主要結(jié)構(gòu)基因之一，基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析通常選用看家基因作為內(nèi)參[7]。本研究以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究關(guān)嶺牛MYH3和MYH4基因mRNA在不同發(fā)育階段的表達(dá)水平，旨在為研究MYH3和MYH4基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗(yàn)的試驗(yàn)動(dòng)物是關(guān)嶺牛，在貴州省安順市西秀區(qū)幺鋪鎮(zhèn)關(guān)嶺牛養(yǎng)殖場，挑選9 頭關(guān)嶺牛，選取其小腸、肝臟、肌肉、心臟、脂肪組織等，其中胎兒3 頭、18月齡3 頭、30月齡3 頭，用碳酸二乙酯洗滌組織以去除表面血液，使用錫箔包好，放入液氮中，隨后將其儲(chǔ)存在-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑

1.3 總RNA提取和cDNA合成

取50mg 組織樣于液氮中研磨到只有米粒一般大小后，利用Tr-izol 法對關(guān)嶺牛組織樣品的總RNA進(jìn)行提取，并選用微量分光光度檢測其濃度與純度。為了檢測RNA是否完整，應(yīng)該使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳。按照TransStartOne-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)體系見表1。25℃10 min 后，42℃30 min，85℃5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及熒光定量PCR

根據(jù)Genbank 登錄的相關(guān)基因序列，結(jié)合Primer 5.0 軟件分析，設(shè)計(jì)GAPDH、MYH3和MYH4基因特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表2。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)是以cDNA 為模板，采用10 μL 反應(yīng)體系（表3），整個(gè)分析過程是定量的，采用熒光定量PCR儀（CFX96，Bio-Rad，USA）。GAPDH作為內(nèi)參基因，得到優(yōu)化以后，其反應(yīng)條件最佳為：在50℃條件下，孵育2 min，并在94℃的條件下預(yù)先變性5 min，并在該條件下進(jìn)行30 s的變性，最后進(jìn)行30 s的退火操作（退火所需溫度如表2 所示），繼而在72℃條件下進(jìn)行30 s的延伸。需要進(jìn)行檢測的平行樣品數(shù)為3個(gè)。當(dāng)反應(yīng)完成以后，可通過熔解曲線對PCR的反應(yīng)特性進(jìn)行研究判斷，僅僅進(jìn)行判斷是不可行的，必須依據(jù)相應(yīng)的定量分析結(jié)果，而其結(jié)果還需要依照標(biāo)準(zhǔn)曲線及Ct值的計(jì)算獲取。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列及參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)分析

在本次試驗(yàn)方案中，將GAPDH基因作為內(nèi)參基因，并通過SPSS 18.0 軟件對樣品進(jìn)行Ct平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算工作。應(yīng)用2-△△CT法處理數(shù)據(jù)，研究在不同年齡階段的MYH3基因以及MYH4基因mRNA的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與RT-PCR結(jié)果分析

總RNA通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)其有著清晰的不同條帶（圖1），適用于逆轉(zhuǎn)錄。用MYH3基因、MYH4基因和GAPDH基因引物先在普通PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測是否為目的條帶。

2.2 熒光定量PCR產(chǎn)物特異性分析

圖1 總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

本試驗(yàn)對MYH3基因和MYH4基因在關(guān)嶺牛不同月齡中的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于GAPDH、MYH3和MYH4基因，其擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)S型（分別見圖2和圖3），這說明GAPDH、MYH3和MYH4基因有著較好的平行性，且其拐點(diǎn)十分明顯，在基線上沒有明顯的上升發(fā)展，梯度模版熔解曲線比較緊密（分別見圖4和圖5）。且只存在1個(gè)顯著的峰，這說明實(shí)際的特定增產(chǎn)物造成熒光的強(qiáng)度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，內(nèi)參及目標(biāo)基因不會(huì)發(fā)生非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，因此以后試驗(yàn)仍可用。

2.3 MYH3和MYH4基因在關(guān)嶺牛不同發(fā)育時(shí)期mRNA表達(dá)水平的分析

圖6 為MYH3和MYH42個(gè)基因mRNA在關(guān)嶺牛不同年齡的表達(dá)，可以看出表達(dá)MYH3基因和MYH4基因mRNA最高的是30月齡的背最長肌，然后為18月齡的背最長肌，而胎兒中的背最長肌表達(dá)量則非常少。

圖2 GAPDH基因的擴(kuò)增曲線

圖3 MYH3基因和MYH4基因的擴(kuò)增曲線

圖4 GAPDH基因的熔解曲線

圖5 MYH3基因和MYH4基因的熔解曲線

圖6 MYH3和MYH4基因在關(guān)嶺牛不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)

3 討論

肌球蛋白的分子結(jié)構(gòu)變化是由于2個(gè)MHC 球形頭部的循環(huán)運(yùn)動(dòng)造成的，也使得其與ATP 得到了有效的融合，這使得肌動(dòng)蛋白很難與頭部進(jìn)行有效的融合，而此時(shí)，ATP的水解反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)力的運(yùn)動(dòng)反應(yīng)[8]。在對mRNA進(jìn)行定量檢測的過程中，必須通過內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行表達(dá)量的確定[9]。通過此次試驗(yàn)，關(guān)嶺牛的MYH3基因和MYH4基因表達(dá)最高的是30月齡的關(guān)嶺牛背最長肌，其次為18月齡的背最長肌，在胎兒背最長肌組織中表達(dá)量最低。MYH3基因和MYH4基因由胎兒到18月齡表達(dá)量有大幅度提升。Ennion 等[10]經(jīng)過研究認(rèn)為組織特異性與發(fā)育階段控制了MYH基因的表達(dá)；Olsvik 等[11]研究發(fā)現(xiàn)MYH基因在胚胎發(fā)育和組織樣品間均表達(dá)不穩(wěn)定。綜上所述，MYH3基因和MYH4基因在出生后的動(dòng)物肌肉組織中表達(dá)量相對較高，MYH3基因和MYH4基因隨著出生時(shí)間的推移呈上升趨勢，推測其表達(dá)水平與肌肉發(fā)育的程度有一定的關(guān)系，但具體的作用機(jī)制比較復(fù)雜，還需通過其他試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在出生后牛的肌肉組織中MYH3基因和MYH4基因具有較高的表達(dá)量，MYH3基因和MYH4基因隨著出生時(shí)間的推移表達(dá)量呈上升趨勢，本研究可為MYH3基因和MYH4基因功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。