不同波長(zhǎng)LED光源對(duì)生物體離體細(xì)胞活性與形態(tài)影響的實(shí)驗(yàn)研究

（金陵科技學(xué)院，南京 210000）

1 引言

21世紀(jì)以來(lái)，智能化的設(shè)備改變了人們的傳統(tǒng)生活方式，各式各樣的智能手機(jī)、平板，電腦、液晶電視不斷涌現(xiàn)，給人們的生活和工作帶來(lái)極大的便利。但是在人們使用智能設(shè)備的液晶屏幕時(shí)，藍(lán)光對(duì)人眼的危害也在同時(shí)進(jìn)行。除了智能設(shè)備終端，隨處可見(jiàn)的LED液晶屏幕也是有害藍(lán)光的主要來(lái)源之一。液晶顯示屏采用的都是LED背光，由于背光需要白光的效果，所以通常使用藍(lán)色LED混合黃色熒光粉來(lái)形成白光。藍(lán)色LED是一個(gè)主體硬件，因此這種白光中的藍(lán)色光譜就擁有一個(gè)波峰。成年人眼晶狀體雖然對(duì)藍(lán)光具有較低的透過(guò)率，但長(zhǎng)時(shí)間暴露在藍(lán)光下仍然會(huì)造成視網(wǎng)膜的退行性改變，形成光致視網(wǎng)膜炎。

有研究燈光與照明系統(tǒng)的學(xué)者將光源對(duì)人體的危害進(jìn)行了4級(jí)分類(lèi)，分別為無(wú)危險(xiǎn)級(jí)別，低危險(xiǎn)級(jí)別（1類(lèi)），中危險(xiǎn)級(jí)別（2類(lèi)）和高危險(xiǎn)級(jí)別（3類(lèi)），分類(lèi)的主要依據(jù)是光源的輻射亮度以及人體產(chǎn)生不適感覺(jué)的主觀(guān)程度，但對(duì)于不同波長(zhǎng)的光源輻射以及輻射不同時(shí)間下的生物組織狀態(tài)變化則研究較少。本文采用LED光照射生物體離體培養(yǎng)的細(xì)胞，控制使用不同波長(zhǎng)的光源和不同的照射時(shí)間，來(lái)研究輻射參數(shù)對(duì)人體離體細(xì)胞的活性與形態(tài)的變化，通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)人體離體細(xì)胞受光輻射危害的程度做出判斷。

2 材料與方法

2.1 材料

研究中為了確定不同波長(zhǎng)的光對(duì)細(xì)胞的影響，選擇光源分別為紫光LED，其主要波長(zhǎng)范圍為395nm～400nm；藍(lán)光LED，其主要波長(zhǎng)范圍為450nm～460nm；紅光LED，其主要波長(zhǎng)范圍為620nm～630nm；以及白光LED，其輸出功率相同，均為4.5W。而實(shí)驗(yàn)對(duì)象則選擇細(xì)胞為人體離體細(xì)胞，其原因?yàn)檫x用活體細(xì)胞則可能由于自身代謝較快而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大影響，導(dǎo)致結(jié)論的不準(zhǔn)確。

2.2 方法

細(xì)胞活性是判斷體外培養(yǎng)細(xì)胞在某些條件下是否能正常生長(zhǎng)的重要指標(biāo)，如藥物處理、放射或紫外線(xiàn)照射、培養(yǎng)條件變化等，它是從事相關(guān)方面的科學(xué)研究的常用手段，更是體外篩選抗腫瘤藥物和臨床腫瘤藥敏試驗(yàn)的重要方法之一。目前常用的方法很多，如有臺(tái)盼藍(lán)染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素滲入法、MTT法、CCK-8法等。

當(dāng)使用MTT法測(cè)試細(xì)胞活性時(shí)，需要使用裂解液溶解甲贊晶體沉淀，可能遇到顆粒不完全溶解以及在吸取上清的操作中也極易帶走部分細(xì)胞等問(wèn)題，導(dǎo)致了MTT法的檢測(cè)穩(wěn)定性不佳，對(duì)于重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果容易出現(xiàn)較大差異。為了實(shí)驗(yàn)的操作方便以及實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，本研究選擇了CCK-8法。CCK-8法使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑，能快速檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度很高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度，重復(fù)性?xún)?yōu)于MTT 法，對(duì)細(xì)胞毒性小，另外，CCK-8法中的細(xì)胞活性檢測(cè)試劑為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開(kāi)即用。

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性的原理：Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8[化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye），生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞液的吸光度值，便可檢測(cè)出待測(cè)細(xì)胞樣品的活性。

細(xì)胞活性測(cè)定

（1）當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)到80-90%后，棄掉培養(yǎng)基，加入PBS系三次，加入2ml胰酶消化5min，加入同等體積培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，離心分離，再加入新培養(yǎng)基。

（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞密度到5×104/ml，于96孔板，每孔接種100ul細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)24小時(shí)。

（3）棄掉培養(yǎng)基，加新培養(yǎng)基100ul/孔，分別用4種不同光源（紫光、藍(lán)光、紅光、白光）對(duì)細(xì)胞分別進(jìn)行光照1小時(shí)和2小時(shí)

（4）向每孔加入10ul CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵化1-4小時(shí)。

（5）用酶標(biāo)儀分別測(cè)定1小時(shí)和2小時(shí)在450nm處的吸光度。

細(xì)胞形態(tài)測(cè)量

（1）當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)到80-90%后，棄掉培養(yǎng)基，加入PBS系三次，加入2ml胰酶消化5min，加入同等體積培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，離心分離，再加入新培養(yǎng)基。

（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞密度到5×104/ml，于96孔板，每孔接種100ul細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)24小時(shí)。

（3）在未有光源照射時(shí)，先觀(guān)察每組細(xì)胞形態(tài)變化。

（4）再分別用4種不同光源（紫光、藍(lán)光、紅光、白光）對(duì)細(xì)胞分別進(jìn)行光照1小時(shí)和2小時(shí)，在顯微鏡下觀(guān)察相同時(shí)間下每組細(xì)胞的形態(tài)變化。主要觀(guān)察細(xì)胞表面的形態(tài)是否規(guī)整，細(xì)胞的邊緣是否光滑，細(xì)胞的碎片是否很多，是否有細(xì)胞由黑點(diǎn)變成了亮點(diǎn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 光輻射對(duì)細(xì)胞活性的影響

在細(xì)胞受光輻射之前測(cè)得其平均吸光度為0.1602875，再分別用紫光、藍(lán)光、紅光、白光LED照射細(xì)胞，測(cè)得1h和2h時(shí)的細(xì)胞吸光度。在1h時(shí)測(cè)得的細(xì)胞吸光度與未受光輻射時(shí)沒(méi)有明顯變化，而細(xì)胞受光輻射2h后測(cè)得的數(shù)據(jù)如下表：

表1 細(xì)胞受不同波長(zhǎng)LED光照射2h后的吸光度平均值和方差表（單位：吸光度）

生物體細(xì)胞在受紫光LED照射2h后，吸光度下降較大，并且方差是所有結(jié)果中最高的，表明紫光照射對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了較為顯著且強(qiáng)烈波動(dòng)的影響；而藍(lán)光照射2h后，細(xì)胞吸光度下降程度最高，表明該種波長(zhǎng)的光與生物體作用最明顯，藍(lán)光產(chǎn)生的光化反應(yīng)最多；紅光LED照射2h后，細(xì)胞的平均吸光度有所上升，表明該波長(zhǎng)的光對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定程度的促進(jìn)作用，使得吸光物質(zhì)含量上升；白光的效果與藍(lán)光較為接近，但方差較小，表明了白光LED中具有與藍(lán)光接近的成分，但影響程度較為均衡。

對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，可以得到以下結(jié)論：根據(jù)2h時(shí)的測(cè)得的細(xì)胞吸光度數(shù)據(jù)的方差，可以看出：藍(lán)光、紅光和白光對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)集中度相對(duì)較高，表明藍(lán)光、紅光和白光對(duì)細(xì)胞的影響程度比較均勻，而紫光對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)集中度相對(duì)較低，表明紫光對(duì)細(xì)胞的影響程度差異性較大。根據(jù)2h時(shí)測(cè)得的細(xì)胞吸光度數(shù)據(jù)的平均值，可以看出細(xì)胞在經(jīng)過(guò)2h的不同波長(zhǎng)光的照射情況下，藍(lán)光照射2h后的細(xì)胞所測(cè)得的細(xì)胞吸光度在四種光對(duì)細(xì)胞照射2h后測(cè)得的吸光度中數(shù)值最低，藍(lán)光對(duì)細(xì)胞的活性的影響最大，會(huì)使細(xì)胞活性處于最低的狀態(tài)，即藍(lán)光對(duì)細(xì)胞的危害程度最高。

3.2 細(xì)胞形態(tài)的分析

在細(xì)胞受光輻射之前拍攝其形態(tài)，再分別用紫光、藍(lán)光、紅光、白光LED照射細(xì)胞，用顯微鏡記錄受照射1h和2h后的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，光輻射1h后拍攝的細(xì)胞形態(tài)與未照射時(shí)幾乎無(wú)變化，而受光照射2h后拍攝的的細(xì)胞形態(tài)則出現(xiàn)較為明顯的變化，結(jié)果如下圖所示。

圖3 細(xì)胞受不同波長(zhǎng)LED光輻射前后形態(tài)圖

圖中，（a）為人體離體細(xì)胞未受光輻射時(shí)形態(tài)圖，（b）（c）（d）（e）分別對(duì)應(yīng)紫光、藍(lán)光、紅光、白光LED光輻射2h后的細(xì)胞形態(tài)。

對(duì)于以上的細(xì)胞形態(tài)圖片的分析，未照射時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)比較規(guī)整，細(xì)胞的邊緣很光滑，細(xì)胞碎片不多。在受紫光、藍(lán)光、紅光和白光LED照射2h后，出現(xiàn)了與初始狀態(tài)較大的變化。其中受藍(lán)光照射2h后的細(xì)胞形態(tài)已經(jīng)模糊，細(xì)胞的基本外形已消失，細(xì)胞碎片較多，而在受紫光和白光照射2h后的細(xì)胞中，有少許形態(tài)模糊的細(xì)胞和少許細(xì)胞碎片，紅光照射2h時(shí)的細(xì)胞中，細(xì)胞邊緣有變形，整體情況稍好。由此可見(jiàn)，在選擇的四種光中，藍(lán)光對(duì)細(xì)胞形態(tài)的損害最為嚴(yán)重，即藍(lán)光輻射對(duì)細(xì)胞的危害程度最高。

生物組織與常規(guī)光學(xué)介質(zhì)不同，因?yàn)槠鋬?nèi)部結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，包含了大量不同體積，不同種類(lèi)的細(xì)胞，而每一種細(xì)胞的細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核的大小形狀也不同，所以對(duì)光的折射、反射以及吸收效果也就各不相同。吸收是影響光在生物組織內(nèi)傳播的主要物理現(xiàn)象之一，通過(guò)吸收效應(yīng)，生物組織可以將光能量轉(zhuǎn)化為其他形式的能量，比如分子的動(dòng)能、其他波長(zhǎng)的熒光輻射能量等，進(jìn)而影響到組織中的細(xì)胞與分子基團(tuán)，導(dǎo)致生物體生理狀態(tài)的改變。在本的研究結(jié)果中，對(duì)于藍(lán)光產(chǎn)生最大影響的原因是長(zhǎng)時(shí)間過(guò)量的藍(lán)光輻射會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中活性氧水平快速上升，進(jìn)而引發(fā)一系列的代謝過(guò)程，其部分中間產(chǎn)物導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞和組織造成殺傷，從而造成不可逆的損傷，體現(xiàn)出細(xì)胞活性的下降與形態(tài)的變化。

4 結(jié)束語(yǔ)

本研究通過(guò)使用紫光、藍(lán)光、紅光、白光等不同波長(zhǎng)的LED對(duì)人體離體細(xì)胞進(jìn)行相同時(shí)間的輻射，選擇細(xì)胞的活性和形態(tài)作為參數(shù)進(jìn)行研究與分析，從而對(duì)人體離體細(xì)胞受藍(lán)光危害的程度做出判斷。在進(jìn)行1h照射時(shí)，細(xì)胞的活性與形態(tài)均變化不明顯，可以證明，人體在受光輻射不長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的影響可以通過(guò)自身的調(diào)節(jié)而消除；而在2h照射后，藍(lán)光照射后的細(xì)胞吸光度處于最低的狀態(tài)，而其他波長(zhǎng)的光也都產(chǎn)生程度不等的影響，也即長(zhǎng)時(shí)間的光輻射均為產(chǎn)生細(xì)胞損傷，而藍(lán)光對(duì)細(xì)胞活性的影響最大；，通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀(guān)察也可以證明，長(zhǎng)時(shí)間的光輻射均可以得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大的變化，也同樣是藍(lán)光對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響最為顯著。