一株苯酚降解菌的篩選、鑒定及相關(guān)降解特性

陳禹竹，唐琦勇，顧美英，朱 靜 ，劉曉靜，崔衛(wèi)東 ，張志東,

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊 830046；3. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】苯酚(Phenol，C6H5OH)，又名石炭酸，是一種酚類化合物，毒性大，難降解[1]。環(huán)境中的苯酚主要來自煉焦、煉油、制取煤氣、制造酚及其化合物和用酚作原料等工廠工業(yè)排放的各種含酚廢水和廢氣等[2]，不經(jīng)處理的含酚廢料進(jìn)入大氣或滲入地下，污染大氣、地下水和農(nóng)作物等，進(jìn)入環(huán)境中對動植物及人類健康造成極大威脅[3]，苯酚是國內(nèi)外環(huán)境優(yōu)先監(jiān)測的持久性有機(jī)污染物之一。傳統(tǒng)的苯酚的處理方法多為物理化學(xué)法，主要有萃取脫酚法、吸附法[4]、紫外線法[5]、臭氧化法[6]、超聲降解法[7]、光催化氧化法[8]等，但這些方法多數(shù)成本較高，操作復(fù)雜，難以普遍推廣，而生物降解法是利用微生物對酚類物質(zhì)的降解而達(dá)到去除目的，該方法具有經(jīng)濟(jì)高效、無二次污染等特點(diǎn)因而被廣泛使用[9]。篩選出既能耐受高鹽條件又有高效降解苯酚能力的微生物菌株具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，已從污水處理廠、焦化廠、石油污染土壤等環(huán)境分離到一些苯酚降解菌，包括有假絲酵母[10]、假單胞菌[11]、蒼白桿菌[12]、產(chǎn)堿菌屬[13]、紅球菌屬[14]、不動桿屬[15]、芽孢桿菌[16]等，均對苯酚具有較好的降解作用。【本研究切入點(diǎn)】由于苯酚工業(yè)污水成分復(fù)雜，含鹽量較高，會使一些降解菌的生長速率和降解速率迅速下降[17]，限制了大多數(shù)降解微生物在污水處理中的應(yīng)用，使得處理相關(guān)污水時一般會進(jìn)行稀釋或進(jìn)行前處理，無形中增加了處理系統(tǒng)的工作負(fù)荷。研究篩選苯酚化合物相關(guān)降解微生物，確定其相關(guān)功能特性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以苯酚為篩選壓力，從中國輻射污染區(qū)鹽爪爪根際微生物中分離篩選得到一株苯酚高耐受菌，分析其生物學(xué)鑒定及其相關(guān)特性，研究菌株對苯酚和酚類化合物玉米赤霉烯酮的降解特性，為苯酚及酚類化合物的生物降解提供新的研究材料，為開發(fā)利用相關(guān)菌株奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

鹽爪爪于2018年4月采自中國輻射污染區(qū)某匯水區(qū)，該區(qū)域?qū)儆诘湫偷母珊祷哪貐^(qū)。采集鹽爪爪完整植株，盡可能地保證其根部的完整性，利用無菌細(xì)毛刷輕刷根部收集根際土壤樣品，土樣經(jīng)充分混勻后轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

R2A培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.25 g/L，酸水解酪蛋白0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，可溶性淀粉0.5 g/L，丙酮酸鈉0.3 g/L，蛋白胨0.25 g/L，葡萄糖0.5 g/L，K2HPO40.3 g/L，MgSO40.1 g/L，瓊脂 20 g/L(固體培養(yǎng)基)，pH 7.0。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO42.25 g/L，KH2PO42.25 g/L，(NH4)2PO41.0 g/L，MgCl2·6H2O 0.2 g/L，CaCl20.01 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.02 g/L，NaCl 20 g/L，瓊脂 20 g/L(固體培養(yǎng)基)，pH 7.0。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，瓊脂 20 g/L(固體培養(yǎng)基)，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器

電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；振蕩器(搖床)，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；紫外分光光度計，日本島津公司；高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株分離篩選

無菌條件下稱取5.0 g根際土壤樣品，置于裝有50 mL含有1 g/L苯酚和2% NaCl的R2A液體培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min條件下振蕩富集培養(yǎng)4 d，吸取上述培養(yǎng)物懸液1 mL，經(jīng)梯度稀釋后，涂布至含有1 g/L苯酚和2% NaCl的R2A培養(yǎng)基平板上，于30℃下恒溫培養(yǎng)3～15 d，待菌落長出后，菌株根據(jù)菌落的形態(tài)、大小及顏色進(jìn)行初步篩選，分離純化后接至R2A培養(yǎng)基斜面上，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株分子鑒定

采用菌落克隆方法，利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化回收后，送至北京鼎國生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。所測得序列經(jīng)手工校對后,通過EzTaxon數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)進(jìn)行比對，調(diào)取同源性最高的模式菌株序列，使用MEGA 7.0進(jìn)行ClustalX多重比對，并使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉值(Bootstrap)為1 000，初步獲得菌株的生物學(xué)分類地位。

1.2.3 菌株的抗逆特性及功能特性

菌株的生長溫度測定采用含有2% NaCl的R2A培養(yǎng)基進(jìn)行；菌株的耐鹽特性測定采用含有不同濃度NaCl的R2A培養(yǎng)基進(jìn)行；耐苯酚特性測定采用含有不同濃度苯酚的R2A培養(yǎng)基進(jìn)行；菌株的酯酶、淀粉酶、蛋白酶、果膠酶特性分別采用加有1%的吐溫80、可溶性淀粉、脫脂奶粉和果膠的R2A培養(yǎng)基進(jìn)行。

1.2.4 菌株利用芳香族化合物生長性況

分別配置含1 g/L的苯、二甲苯、二苯胺、I-萘胺和對羥基苯甲酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，接入實(shí)驗(yàn)菌株，培養(yǎng)3～5 d后，測量不同芳香族化合物菌液OD600，確定其生長情況。

1.2.5 苯酚測定

利用4-氨基安替比林分光光度法[18]測定苯酚的含量。配制苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確稱取0.100 0 g苯酚，配置成100 mg/L的苯酚溶液。分別移取1、2、4、6、8和10 mL苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50 mL比色管中，稀釋定容至刻度。在6支比色管中分別加入0.5 mL氨水-氯化銨緩沖液，混勻，此時pH為10±0.2，然后加入1.0 mL的2% 4-氨基安替比林溶液，再加入1.0 mL的8%鐵氰化鉀溶液，充分混勻，放置10 min后，立即于510 nm波長處，以水為參比，測定其吸光度。最后繪制吸光度對苯酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液經(jīng)預(yù)處理后測定苯酚含量，移取1 mL樣品溶液，在7 000 r/min下離心1 min，取1 mL上清液，用于檢測苯酚含量。

1.2.6 菌株苯酚降解特性

挑取一環(huán)活化菌株菌苔，接種到裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的大試管中，于30℃、120 r/min條件下，培養(yǎng)16 h，以2%的接種量接種菌液至苯酚初始濃度為0.5、0.75、1.0、1.25和1.5 g/L的R2A液體培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min條件下培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7 d并取樣，測定不同苯酚初始濃度下菌株苯酚的降解情況。

1.2.7 菌株對玉米赤霉烯酮的降解特性

同樣方法制備種子培養(yǎng)液，以2%的接種量接種菌液至含有10 μg/L玉米赤霉烯酮的LB液體培養(yǎng)基中，于30℃，120 r/min條件下培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7 d并取樣，測定不同培養(yǎng)時間下菌株降解玉米赤霉烯酮的降解特性。檢測方法如參考文獻(xiàn)[19]采用的HPLC法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

利用含有1%苯酚的R2A培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)3～15 d，經(jīng)菌落形態(tài)觀察，共挑取各類菌株72株，通過進(jìn)一步的苯酚耐受性篩選和苯酚降解率的初步測定，優(yōu)選出一株編號為YZZ-9的菌株，該菌為革蘭氏陽性、球菌，菌落直徑2～3 mm，菌落淡黃色、光滑、不透明，邊緣不規(guī)則。圖1

圖1 菌株YZZ-9的菌落和菌體形態(tài)
Fig. 1 Colony and cell morphology of the Strain YZZ-9

2.2 菌株的分子鑒定

菌株YZZ-9通過16S rDNA序列PCR擴(kuò)增和測序，并與EzTaxon數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似度比較，同時調(diào)取菌株相似性最高模式菌株序列，利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，該菌株歸屬于考克氏屬(Kocuria)，其與Kocuriapalustris(沼澤考克氏菌)DSM 11925T同源性最高，達(dá)到100%，確定其為沼澤考克氏菌分離株。圖2

2.3 菌株的抗逆特性及功能特性

研究表明，該菌株可以最高耐受3.5 g/L的苯酚，10%的NaCl，可在10～45℃下生長，可以產(chǎn)生酯酶和淀粉酶。表1

表1 菌株抗逆特性及功能特性
Table 1 Stress resistance and functional characteristics of strains

抗逆特性StressResistance結(jié)果Result產(chǎn)酶情況Enzymeproduction結(jié)果Result苯酚0～3.5g/L酯酶+NaCl0～10g/L淀粉酶+溫度10～45℃蛋白酶-pH5.0～11.0果膠酶-

注：“+”表示有活性;“-”表示無活性

Note: “+” indicates active; “-” indicates inactive

圖2 基于菌株YZZ-9的NJ進(jìn)化樹
Fig. 2 Neighbor-Joining tree based on the Strain YZZ-9

2.4 菌株利用芳香族化合物生長

研究表明,菌株YZZ-9具有多種芳香族化合物的利用能力，其中對I-奈胺的利用生長最好，最大生長OD600可達(dá)到0.496，其次為苯酚，OD600可達(dá)到0.176，而對苯和對羥基苯甲酸二甲苯幾乎不利用。圖3

圖3 菌株利用芳香族化合物生長情況
Fig. 3 Growth of strains utilizing aromatic compounds

2.5 菌株對苯酚的降解特性

2.5.1 苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)吸光度與苯酚濃度的對應(yīng)關(guān)系，以苯酚濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0～1.6 g/L具有較好的線性關(guān)系，方程為y=1.226 2x-0.001，相關(guān)指數(shù)R2=0.999。圖4

2.5.2 菌株苯酚降解特性

研究表明,選擇的幾個濃度下培養(yǎng)，菌體生長至48 h時其OD600均不再增長，盡管苯酚的增加對菌體生長有一定的影響，但整體來說影響不大。圖5

不同初始苯酚濃度對菌株降解苯酚的效果影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基初始苯酚濃度為0.5 g/L時，菌株在48 h內(nèi)可將苯酚完全降解，但隨著苯酚初始濃度的增高，完全降解所需的時間逐漸延長，當(dāng)苯酚濃度達(dá)到1.25 g/L，苯酚降解效率明顯降低，120 h內(nèi)僅降解率為24.4%，而當(dāng)濃度達(dá)到1.5 g/L時，菌株對苯酚的降解基本停滯，120 h時降解率不足5.0%。圖6

圖4 苯酚濃度對應(yīng)吸光度曲線
Fig. 4 Working curve of phenol concentration corresponding to absorption

圖5 不同初始苯酚濃度下菌體生長情況
Fig.5 The growth of bacterium in different initial phenol concentrations

圖6 菌株在不同苯酚濃度下降解情況
Fig. 6 Degradation of bacteria in different phenol concentrations

2.6 菌株對玉米赤霉烯酮的降解情況

研究表明,菌株YZZ-9在含有10 μg/mL玉米赤霉烯酮的LB培養(yǎng)基中能很好的生長，其在培養(yǎng)18 h后即達(dá)到對數(shù)期后期，其后進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株對玉米赤霉烯酮的降解，隨著菌體增加緩慢發(fā)生，但降解過程主要發(fā)生在穩(wěn)定期，玉米赤霉烯酮的降解速率也有所加快，至培養(yǎng)144 h時菌株對培養(yǎng)基中玉米赤霉烯酮降解率可達(dá)68.9%。圖7

圖7 菌株YZZ-9的生長曲線和玉米赤霉烯酮的降解曲線
Fig. 7 Growth curve of the Strain YZZ-9 and degradation curve of zearalenone

3 討 論

植物根際存在著豐富多樣的微生物種群，具有較強(qiáng)的污染物降解能力。Tejeda-Agredano MC等[19]發(fā)現(xiàn)向日葵的根際微生物對土壤中的多環(huán)芳烴具有很好的降解能力，李喬平[20]研究發(fā)現(xiàn)豆科植物根際菌群對菲具有較好的降解能力，申圓圓[21]從紅三葉草根際土壤中分離出一株高效石油降解菌。這些具有高效降解能力的植物根際微生物，為生物修復(fù)土壤、水體中有毒有害化合物提供了科學(xué)依據(jù)。苯酚作為典型的酚類化合物，其毒性大，難降解，進(jìn)入環(huán)境中會對動植物及人類健康造成極大威脅。

近年來，發(fā)現(xiàn)鹽環(huán)境中存在著多樣的苯酚降解微生物。其中，對新疆艾丁湖中苯酚降解菌多樣性研究[22]發(fā)現(xiàn)，所分離的擬諾卡氏(Nocardiopsis)菌屬、Bacillus、Gracilibacillus、Pontibacillus、Halobacillus、Marinococcus和Halomonas屬均可降解苯酚，但降解效率較低。鹽爪爪是典型的鹽生植物，廣泛分布在鹽堿荒漠生境[23]，在其生長過程中，其根際土壤的多種離子濃度顯著提高，會形成根際“離子島”效應(yīng)。前期研究發(fā)現(xiàn)[24],其存在著豐富的微生物多樣性，其中70%的分離株具有耐受10% NaCl的能力，40%的分離株可耐受不同濃度的重金屬脅迫。在其根際微生物碳源代謝過程中，發(fā)現(xiàn)其根際存在較強(qiáng)的酚酸類化合物降解的功能，為實(shí)驗(yàn)的開展奠定了基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)外已分離篩選出許多苯酚降解菌。Zhenghui Liu等[25]從石化廢水中分離出一株苯酚降解菌株P(guān)A，經(jīng)鑒定為醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)，該菌株在48 h內(nèi)能去除91.6%的初始濃度800 mg/L的苯酚，對苯酚濃度的耐受性高達(dá)1 700 mg/L。魏霞等[26]從污水處理廠的活性污泥中分離出一株苯酚降解菌，初步鑒定菌株屬于紅球菌(Rhodococcussp.)，該菌株能耐受4%的鹽度，在48 h內(nèi)對1.5 g/L苯酚的降解率在90%以上。Hui Liu等[27]從土壤樣品中分離出一種能夠降解高濃度苯酚的新型酵母菌株TrichosporonmontevideensePHE1，該菌株在18 h內(nèi)可降解99.5%初始濃度為1 200 mg/L的苯酚，能耐受2 500 mg/L濃度的苯酚。研究通過以苯酚為篩選壓力，從鹽爪爪根際微生物中通過富集、平板分離獲得一株對苯酚具有良好降解能力的菌株YZZ-9，經(jīng)16S rDNA序列分析，確定該菌株屬于Kocuriapalustris(沼澤考克氏菌)，兩者16S rDNA序列同源性達(dá)到100%。相關(guān)研究表明，Kocuria屬具有較強(qiáng)的抗逆特性和污染物降解能力[28-29]。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，菌株YZZ-9也具有較好的苯酚、溫度和鹽堿耐受性，同時可以利用多種苯類化合物為單一碳源而生長。

研究中，通過對培養(yǎng)基中不同濃度苯酚下菌株的生長和苯酚降解特性分析發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中的苯酚濃度增加，菌株對苯酚降解效率明顯下降，完全降解所需的時間明顯的延長。當(dāng)培養(yǎng)基濃度低于1.0 g/L時，菌株可在120 h內(nèi)完全降解；當(dāng)苯酚濃度達(dá)到1.25 g/L時，仍具有一定的降解效果；當(dāng)苯酚濃度達(dá)到1.5 g/L時，培養(yǎng)基中的苯酚降解幾乎被抑制。如趙宇虹[30]等和劉桂萍[31]等也發(fā)現(xiàn)當(dāng)苯酚濃度增加會明顯降低菌株的降解效率，一般認(rèn)為，這主要是因?yàn)楦邼舛缺椒油ㄟ^抑制菌體生長造成的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中的苯酚濃度增加菌體生長有所下降，但影響有限，如當(dāng)苯酚濃度為0.5和1.5 g/L時，兩者OD值最高相差不足30%，但苯酚的降解效率相差卻極大，高濃度苯酚可能通過其它機(jī)理抑制菌株對苯酚的降解，相關(guān)研究還有待進(jìn)一步分析。

同時，研究也發(fā)現(xiàn)菌株YZZ-9可明顯降解玉米赤霉烯酮。玉米赤霉烯酮全名為6-(10-羥基-6-氧代-反式-1-十一碳烯基)-β-環(huán)戊酸內(nèi)酯，是由真菌產(chǎn)生的一種非甾體類雌激素真菌毒素，是世界范圍內(nèi)谷類作物的常規(guī)污染物，危害極大[19]。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株對玉米赤霉烯酮降解過程主要發(fā)生在穩(wěn)定期，菌株培養(yǎng)至144 h時，對培養(yǎng)基中玉米赤霉烯酮降解率可達(dá)68.9%，為相關(guān)生物降解玉米赤霉烯酮提供了科學(xué)材料。由于玉米赤霉烯酮分子中含有酚類結(jié)構(gòu)，菌株是否以破壞其分子中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)而達(dá)到降解玉米赤霉烯酮，相關(guān)降解機(jī)制還有待進(jìn)一步分析。

4 結(jié) 論

4.1 通過富集、平板分離獲得一株對苯酚具有良好降解能力的菌株YZZ-9，經(jīng)16S rDNA序列分析，確定該菌株屬于Kocuriapalustris(沼澤考克氏菌)，兩者16S rDNA序列同源性達(dá)到100%。該菌株具有較好的苯酚、溫度和鹽堿耐受性，同時可以利用多種苯類化合物為單一碳源而生長。

4.2 菌株的生長隨著培養(yǎng)基中的苯酚濃度加而下降，但影響不明顯，而對苯酚降解效率影響較為明顯。當(dāng)培養(yǎng)基中苯酚濃度不斷增加，完全降解所需的時間明顯的延長。當(dāng)培養(yǎng)基濃度低于1.0 g/L 時，菌株可在120 h 內(nèi)完全降解；當(dāng)苯酚濃度達(dá)到1.5 g/L，培養(yǎng)基中的苯酚降解幾乎完全被抑制。

4.3 菌株YZZ-9可明顯降解玉米赤霉烯酮，但降解過程主要發(fā)生在穩(wěn)定期，菌株培養(yǎng)144 h時，對培養(yǎng)基中玉米赤霉烯酮降解率可達(dá)68.9%。