達(dá)坂城蠶豆根腐病病原菌鑒定及生防菌拮抗效果分析

楚 敏，顧美英，唐琦勇，朱 靜，郝秀英，張志東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】近年來(lái)，達(dá)坂城地區(qū)蠶豆大面積出現(xiàn)根莖病害，導(dǎo)致蠶豆大面積死苗、植株干枯，減產(chǎn)嚴(yán)重，甚至絕產(chǎn)。2009年后達(dá)坂城地區(qū)蠶豆種植面積削減90%以上，2016年后種植面積不足千畝，嚴(yán)重影響了達(dá)坂城蠶豆品牌的發(fā)展[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蠶豆是典型的忌連作作物，長(zhǎng)年連作會(huì)導(dǎo)致其根莖病害發(fā)病嚴(yán)重[2]。根據(jù)發(fā)病部位的不同，蠶豆根莖病害可分為根腐病和莖腐病，其病原菌的區(qū)系組成以鐮刀菌為主，極少數(shù)為立枯絲核菌引起，其發(fā)病一般在蠶豆花期發(fā)生，田間積水或苗期澆水過(guò)早，病害發(fā)生重。相關(guān)研究表明，其發(fā)病率與土壤溫度、田間濕度、品種病害敏感性呈正相關(guān)[2]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】此前未見達(dá)坂城地區(qū)蠶豆有根莖病害發(fā)病的報(bào)道。 2009年以來(lái)，達(dá)坂城區(qū)域蠶豆根莖病害發(fā)病日益嚴(yán)重，主要采用加大輪作，降低種植密度外，多采用甲霜靈、福美雙按5∶1比例復(fù)配后灌根的方法[3]降低相關(guān)病害的發(fā)病率，達(dá)坂城蠶豆根莖發(fā)病規(guī)律、致病菌種類及生物防治等，目前尚無(wú)研究報(bào)道。研究鑒定達(dá)坂城蠶豆根腐病病原菌?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】實(shí)地調(diào)查達(dá)坂城本地特色蠶豆品種根莖病害發(fā)病情況并采樣，進(jìn)行病原菌的分離鑒定，研究達(dá)坂城蠶豆病原菌的分類學(xué)地位；通過(guò)平板拮抗實(shí)驗(yàn)，分析市面銷售微生物菌劑對(duì)病原菌株的拮抗效果，為達(dá)坂城蠶豆根莖病害的科學(xué)生物防治提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病株采集

采樣地位于達(dá)坂城地區(qū)(43°21.284’ N, 88°21.277’ E)，海拔高度在1 100 m左右，屬于中溫帶大陸性氣候地區(qū)，干旱少雨，年平均降水量43.4 mm，寒暑變化劇烈，氣候差異較大，多大風(fēng)天氣，年平均氣溫6.3～7.5℃，1月平均氣溫為-10.6℃，7月平均氣溫為18℃[4]。

采樣地位于達(dá)坂城鎮(zhèn)東南10 km處，農(nóng)田面積1.67 hm2(25畝)，土質(zhì)為沙礫土，所種植蠶豆為達(dá)坂城蠶豆(農(nóng)民自留種)，耕作模式為機(jī)械耕種，覆膜播種，輪作種植(前一年種植為玉米)，灌溉采用大水漫灌。

分別于2018年6月22日和7月3日前往達(dá)坂城農(nóng)田，采集不同發(fā)病程度的病株10株，整株采用滅菌的牛皮紙包裹后放置車載冰箱，在4 h以內(nèi)分離病株的病原菌。

1.1.2 真菌拮抗菌

芽孢桿菌B6，前期分離的蘋果腐爛病病原菌拮抗菌，保存于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所菌種保藏庫(kù)。枯草芽孢桿菌B1，由新疆神威生物股份有限公司提供。

1.1.3 試劑和設(shè)備

PDA培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；真菌DNA基因組試劑盒，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)技術(shù)有限責(zé)任公司。

CP153電子精密天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司； Nikon 80I熒光顯微鏡型尼康顯微鏡，日本Nikon尼康公司; SW-CJ-2F 型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司; BPH-9042型電熱恒溫培養(yǎng)箱； SPX-250B-Z生化培箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Eppendorf 5417R型離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司。

1. 2 方 法

1.2.1 根莖病害發(fā)病情況

調(diào)查田塊按雙對(duì)角線蛇性布點(diǎn)，共設(shè)9個(gè)點(diǎn)，每個(gè)調(diào)查點(diǎn)觀察植物50棵，對(duì)發(fā)現(xiàn)的植物病株進(jìn)行病情確定，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)點(diǎn)的發(fā)病等級(jí)和發(fā)病率[5]。調(diào)查病害分為5類,0級(jí)：根、莖基部無(wú)病斑、無(wú)變色，生長(zhǎng)健康；1級(jí)：莖基部或根部稍有病斑，地上部無(wú)不良癥狀；2級(jí)：莖基部或主側(cè)有病斑，但不連片，地上部無(wú)不良癥狀；3級(jí)：莖基部或根部小于1/3～1/2出現(xiàn)病斑，地上部萎蔫，變黃；4級(jí)：莖基部或根部病斑環(huán)繞，枯萎，落葉，但植株不死亡；5級(jí)：植株死亡[6]。

1.2.2 病原菌的分離

挑選具有典型癥狀的病株，去葉留主枝干和根，自來(lái)水下沖洗，去除表面泥土和浮灰， 無(wú)菌濾紙擦拭。在無(wú)菌工作臺(tái)中，使用70%酒精表面消毒30 s，其后1.2% NaClO消毒3 min，用無(wú)菌蒸餾水清洗3次進(jìn)行表面消毒，放在無(wú)菌濾紙上晾干。 切取5 mm×5 mm左右具有典型病征的組織塊，移至準(zhǔn)備好的PDA(含氯霉素)和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)，并觀察菌落長(zhǎng)出后挑取邊緣菌絲，進(jìn)行菌種純化和保藏[7]。

1.2.3 病原菌致病性測(cè)定

采用燙傷接種方法，選取健康達(dá)坂城蠶豆枝干，截成10 cm長(zhǎng)的小段，自來(lái)水沖洗后用0.1% HgCl消毒，然后用無(wú)菌水沖洗，濾紙擦拭，晾干，頂端石螬封口。將燒紅針頭按一定間隔燙傷枝條韌皮部，無(wú)菌接種針挑取病原菌菌絲接種燙傷部位，浸濕的脫脂棉輕輕附上后，用塑料保鮮膜將接種處包扎。接種后將枝條放入濕沙盤中，28℃保濕培養(yǎng)，于接種后6、10和15 d觀察記錄枝條發(fā)病情況。

1.2.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

病原真菌ITS 序列采用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’， ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進(jìn)行ITS序列PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化回收后，送往北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)得序列人工校正后，真菌序列在http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/DefaultInfo.aspx數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，細(xì)菌序列在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，并分別調(diào)取同源性最高模式菌株及相關(guān)菌株序列。

1.2.5 生防菌拮抗效果

拮抗菌的篩選采用平板對(duì)峙法進(jìn)行。以分離到的病原菌為指示菌，接種于PDA平板中心，拮抗菌采用四點(diǎn)對(duì)峙法接種，每處理重復(fù)3次，并以未接拮抗菌的病原菌為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d后，觀察并測(cè)定抑菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用MEGA5.0進(jìn)行CLUSTAL X多重比對(duì)，使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]，自舉值為(Bootstrap) 為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 根莖病害發(fā)病情況

達(dá)坂城蠶豆根莖病害主要表現(xiàn)為植株葉片自下向上逐漸變黃枯萎，病葉常扭折、彎曲，干枯脫落。病株莖基部有黑褐色病斑，稍凹陷，甚至干裂，莖基部病斑逐漸向上發(fā)展，致使莖上部分嫩尖傾斜或下垂，最后整個(gè)植株枯死。剖開病莖，病斑根據(jù)病害的等級(jí)由表皮逐漸向內(nèi)部延伸。圖1

根系受害時(shí)，側(cè)根和主根上均產(chǎn)生褐色至黑褐色條紋，逐漸發(fā)展，可導(dǎo)致主根變黑，皮層腐爛，須根全部壞死并消失，且在此過(guò)程中根瘤逐漸減少、消失。病株根系弱小，極易拔出。圖2

注：CK 健康植株；D1-D3不同發(fā)病程度的植株

Note: CK Healthy plants; D1-D3 Plants with different degrees of disease

圖1 達(dá)坂城蠶豆植株病莖剖面
Fig.1 Stem profile of broad faba bean in Dabancheng

注：A-C 為2～4級(jí)發(fā)病情況的病株根莖部；D為2級(jí)發(fā)病植株的莖稈

Note:A-C the root and stem of faba bean of the 2-4 stage disease. D the stem of faba bean of the 2 stage disease

圖2 達(dá)坂城蠶豆根莖病害情況
Fig.2 Root and stem diseases of faba bean in Dabancheng

研究表明，達(dá)坂城蠶豆根莖病害主要開始發(fā)病時(shí)期為6月上中旬，此時(shí)蠶豆為花期或接近開花期。調(diào)查6月22當(dāng)日平均氣溫20℃(27℃ / 13℃，周平均氣溫20.2℃)，地頭和進(jìn)水區(qū)域病害發(fā)生較少，而農(nóng)田中央或低洼積水處多發(fā)生，發(fā)病率最高約為4.0%；至7月后由于氣溫升高，田間濕度加大，植株發(fā)病率明顯升高。至7月3日調(diào)查當(dāng)時(shí)平均氣溫23℃(30℃ / 16℃，周平均氣溫21.5℃)調(diào)查最高可達(dá)到15.5%，病情指數(shù)升高2～3個(gè)級(jí)別，最高達(dá)到5級(jí)，部分植株開始枯萎死亡。表1

表1 達(dá)坂城蠶豆根莖病害調(diào)查
Table 1 Investigation and statistics on root and stem diseases of faba bean in Dabancheng

6月22日J(rèn)une22nd7月3日J(rèn)uly3rd平均發(fā)病級(jí)別Averageincidencelevel發(fā)病率Morbidity(%)平均發(fā)病級(jí)別Averageincidencelevel發(fā)病指數(shù)Incidenceindex(%)備注Note低發(fā)病區(qū)域Lowincidencearea1級(jí)1.52級(jí)3.5地頭進(jìn)水區(qū)域高發(fā)病區(qū)域Highincidencearea2級(jí)4.04～5級(jí)15.5地中,低洼積水區(qū)域

2.2 根莖病害病原菌的分離與鑒定

經(jīng)分離純化，分別從達(dá)坂城蠶豆病害典型樣本中，分離得到潛在病原菌5株，通過(guò)平板生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)學(xué)特征觀察，上述5株菌在PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)快速生長(zhǎng)，菌落均突起絮狀，菌落可高達(dá)3～5 mm，菌絲白色質(zhì)密，培養(yǎng)后期由于大量孢子生成而呈粉質(zhì)。鏡栓觀察，小型分生孢子著生于單生瓶梗上，常聚成球團(tuán)，單胞，卵形；大型分生孢子為鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔，基本確定為一類菌。圖3

圖3 達(dá)坂城蠶豆根莖病害病原菌菌落形態(tài)
Fig.3 Colony morphology of fusarium wilt pathogen from Dabancheng faba bean

2.2.1 病原菌的分子鑒定

所得5株菌株分別提取菌體DNA，利用真菌ITS序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序獲得其ITS序列，并在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)在線比對(duì)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所獲得的5株菌間ITS同源性為100%，均屬于Fusarium屬。進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建表明，菌株與Fusariumchlamydosporumvar.fuscumCBS 635.76T在系統(tǒng)進(jìn)化在同一枝，且具有最高相似性(99.8%)[9]。所得病原菌株極有可能為Fusariumchlamydosporumvar.fuscum。圖4

2.2.2 病原菌致病性驗(yàn)證

將上述5株菌接種至健康的蠶豆莖稈上，并以未接菌的蠶豆莖稈為對(duì)照。觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)分離的5株菌均具有相同的致病性，接種6 d后接種處開始呈棕色；10 d后發(fā)病病斑面積擴(kuò)大，發(fā)病率均為100%，也進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)所得的5株菌可能為同一致病株。 15 d病斑進(jìn)一步擴(kuò)大，病斑出現(xiàn)黑色部分表皮有略微凸起，經(jīng)剖開皮層可以明顯看到病斑向下擴(kuò)展，并深入木質(zhì)部，與實(shí)驗(yàn)采集的病株呈現(xiàn)癥狀相同，所得5株真菌為同一株蠶豆根莖病害病原菌。 圖5

2.3 芽孢桿菌對(duì)蠶豆根莖腐爛病病原菌拮抗效果

拮抗菌的篩選采用平板對(duì)峙法進(jìn)行。以分離到的病原菌為指示菌，接種于PDA平板中心，實(shí)驗(yàn)分別選用項(xiàng)目前期獲得的芽孢桿菌B6和新疆神威生物股份有限公司提供的枯草芽孢桿菌B1進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。拮抗菌采用四點(diǎn)對(duì)峙法接種，每處理重復(fù)3次，并以未接拮抗菌的病原菌為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d后，觀察并測(cè)定抑菌效果。兩株菌均可對(duì)蠶豆病原菌起到有效抑制作用，其抑菌/菌落比可以達(dá)1.90以上,可作為蠶豆根莖病害的生物防治菌劑。圖6

圖4 基于真菌ITS序列建立的病原菌NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.4 NJ phylogenetic tree of pathogenic fungi based on ITS sequence

注：A為對(duì)照；B為對(duì)照10 d后剖面；C為接種病原菌10 d莖稈；D為接種10 d莖稈剖面

Note:A CK；B Longitudinal section of the CK stem 10 days later;C The stem was inoculated by pathogenic fungi for 10 days;D:Longitudinal section of the stem that it was inoculated by pathogenic fungi for 10 days

圖5 蠶豆莖稈病原菌致病性驗(yàn)證
Fig.5 Verification of Pathogenicity of Pathogens on Vicia faba Stem

3 討 論

蠶豆是典型的忌連作作物，連作造成土傳根莖枯萎病嚴(yán)重發(fā)生，加大蠶豆間作可以有效降低該病害的發(fā)生；同時(shí)，蠶豆根莖枯萎病的發(fā)病也與蠶豆的品種、品系有關(guān)。我國(guó)的云南、江蘇、浙江、青海、甘肅等省區(qū)均有蠶豆根莖枯萎病的報(bào)道[10-12]?，F(xiàn)有研究表明，蠶豆根莖枯萎病主要由鐮刀菌引起，已報(bào)道可引起蠶豆根莖枯萎病的鐮刀菌包括銳頂鐮刀菌(F.cuminatum)、尖孢鐮孢(F.axysporum)、串珠鐮孢(F.moniliforme)、F.moniliformevar.subglutinans、燕麥鐮孢(F.avenaceum)、木賊鐮孢(F.equiseti)、三線鐮孢(F.tricinctum)、禾谷鐮孢(F.graminearum)和茄鐮孢(F.solani)[13-16]。新疆此前未見蠶豆根腐病報(bào)道，2009年達(dá)坂城地區(qū)逐漸出現(xiàn)該類病害，并到2015年才對(duì)病害進(jìn)行報(bào)道，但一直未對(duì)真菌致病菌進(jìn)行分離鑒定。

圖6 芽孢桿菌B1對(duì)蠶豆根莖腐爛病病原菌抑制效果
Fig.6 Inhibitory effect of B1 against pathogen of faba bean root rot disease

研究對(duì)達(dá)坂城根莖病害的病原菌進(jìn)行了分離，通過(guò)分子鑒定初步確定為厚孢鐮孢菌變種(Fusariumchlamydosporumvar.fuscum)。厚孢鐮孢菌(Fusariumchlamydosporum)作為植物病原菌，此前在禾本科作物如小麥、玉米的根腐、莖腐病中均有報(bào)道[17-19]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，厚孢鐮孢菌也是引起大豆、石榴、馬唐(Digitariasanguinalis)、橄欖、香蕉、紫花苜蓿等作物根腐病害的主要病原菌之一，由此可見,厚孢鐮孢菌可能是更多作物的病原菌。實(shí)驗(yàn)調(diào)查所在地種植的達(dá)坂城蠶豆，自2009年開始發(fā)現(xiàn)相關(guān)病害發(fā)生后，一直認(rèn)為其病害可能與不當(dāng)引進(jìn)外地蠶豆品種有關(guān)，為了避免病害大面積發(fā)生，其種植模式的發(fā)生采取了輪作模式，如玉米、小麥、苜蓿等，但蠶豆根莖病害還是經(jīng)常發(fā)生，其原因可能是該病原菌也能侵染輪作的其他作物，這一點(diǎn)還有待進(jìn)一步論證。

蠶豆根莖腐爛病的防治可采用20%三唑酮乳油拌種，或75%百菌清可濕性粉劑拌種，苗期用50%多菌靈可濕性粉劑1 000倍液灌根，或用70%甲基硫菌靈可濕性粉劑800～1 500倍液+50%福美雙可濕性粉劑600倍液噴霧等方式進(jìn)行防治，達(dá)坂城蠶豆作為我區(qū)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記產(chǎn)品，不適宜采用傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑的防治，采用生物防治是理想的辦法。前期分離的芽孢桿菌B6和新疆神威生物股份有限公司提供的枯草芽孢桿菌B1均對(duì)病原菌具有良好的抑制效果，但其田間施用效果和使用規(guī)范還需進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

對(duì)新疆達(dá)坂城蠶豆根莖腐爛病病原菌進(jìn)行了分離，獲得潛在病原菌5株，形態(tài)學(xué)觀察確定其均屬于鐮孢菌屬，分子鑒定初步確定均為厚孢鐮孢菌變種(Fusariumchlamydosporumvar.fuscum)。通過(guò)人工接種實(shí)驗(yàn)分離菌株至達(dá)坂城蠶豆莖稈觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株具有很強(qiáng)的侵染性，接種10 d 后觀察，病斑發(fā)生率可達(dá)到100%，并且其發(fā)病癥狀與實(shí)際采樣中莖稈病斑一致，實(shí)驗(yàn)獲得菌株為蠶豆根莖腐爛病致病菌株。采用的芽孢桿菌B6和B1對(duì)病原菌具有較好抑菌效果，其抑菌/菌落比可以達(dá)1.90以上，可作為達(dá)坂城蠶豆根莖腐爛病生防菌。