水稻OsHOX6啟動子的組織特異性表達

何 丹，玉山江·麥麥提，楊 渡,韓 盛,Inez Hortense Slamet-Loedin

(1.新疆維吾爾自治區(qū)林業(yè)技術推廣總站，烏魯木齊 830000；.農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；3.國際水稻研究所作物育種和生物化學系轉基因研究室， 菲律賓)

0 引 言

【研究意義】常見的非生物逆境脅迫環(huán)境因子包括干旱、高鹽、低溫等，制約了植物的生長發(fā)育，影響作物的產(chǎn)量。挖掘水稻抗逆基因并進行功能分析及其機理研究是抗逆育種的基石，水稻的根系生長發(fā)育情況與其抗旱性、抗鹽堿性、抗菌害及地上部分的生理情況關系密切。水稻根系的形態(tài)、生理特性與抗逆性有直接關系[1]。雖然對雙子葉模擬植物擬南芥的根系生長發(fā)育的研究較多，可典型的單子葉植物水稻根系形成與發(fā)育控制基因相關研究則比較有限，水稻根系生長發(fā)育的調控網(wǎng)絡與分子機理以及根系生長發(fā)育相關基因 有待進一步進行克隆和功能研究。水稻根系形成由幾個轉錄因子、激素以及表觀遺傳控制[2]。水稻側根是在中柱鞘細胞和內皮層細胞部位發(fā)生的[3-4]。根的內皮層是根的最基本組織結構，由分生組織分化形成，由數(shù)層薄壁細胞構成，可以起到保護作用，也能控制對物質運輸與根生長發(fā)育的信號中心[5]?！厩叭搜芯窟M展】多數(shù)研究認為，水稻的根系發(fā)育和較多外界因素息息相關，尤其與植物激素關系密切。早期相關研究已經(jīng)表明，諸多外界因素影響著水稻的根系發(fā)育，以植物激素尤為明顯。植物生長素在水稻側根和不定根生長，向性反映和維管組織細胞分化等具有關鍵作用[6]。研究認為較低濃度的植物生長素能夠促進根系生長，而生長素高于一定濃度會抑制水稻根系生長。雙子葉模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)與單子葉植物水稻的根系存在明顯差異，雙子葉植物擬南芥為直根系，沒有不定根，而單子植物水稻為不定根系，具有發(fā)達的須根系。水稻的根系結構非常復雜，有不同的根系類型，包括胚胎初生根、側根和冠根[7]，水稻冠根可持續(xù)分化兩種不同類型的二級根，即小側根和大側根。大側根有不定性和向地性，但大側根無向地性，通常具有確定性。水稻小側根數(shù)量較多，沒有分支，常有小側根和大側根[8]。葫蘆卜中的HD-Zip轉錄因子CHB1/2/3控制體細胞中胚胎發(fā)送的基因表達，CHB2參與到胚胎的早期發(fā)育過程，在成熟的番茄植物中Vahox1在次生生長的韌皮部也能表達，說明其編碼產(chǎn)物優(yōu)先參加到形成層到韌皮部組織的分化過程[9，10]。轉錄因子Oshox1 and Oshox4可能是發(fā)育抑制因子。屬于HD-ZipⅠ家族的Habh-4在初步轉基因擬南芥里過量表達時，能夠表現(xiàn)出較為明顯的抗旱性[11]。試驗表明，過量表達的Oshox1能夠改變擬南芥葉片的形狀和大小、抑制其的生長，且其抑制效應與它的DNA結合位點和HD基序的上游序列有關；過量表達的Oshox4水稻能夠改變葉片、開花期、株高等，這與在GA3的反應中充分表現(xiàn)出負調控作用[12]。水稻的OsHOX6、Oshox22和Oshox24與AtHB7和AtHB12基因具有一定的同源性，在進行干旱脅迫時這些基因會進行對應干旱調控，但截至目前關于此類基因的抗旱功能方面未見報道[13，14]。【本研究切入點】對水稻HD-Zip轉錄因子亞家族I的部分基因功能進行了研究，可OsHOX6基因與啟動子的功能未見報道。研究在OsHOX6基因啟動子特異性表達?！緮M解決的關鍵問題】研究OsHOX6基因啟動子調控GUS基因表達的模式，證實OsHOX6基因主要在根尖的頂端分生區(qū)與內皮層表達。

1 材料與方法

1.1 材 料

采用RT-PCR法，以HPT (潮霉素)引物與OsHOX6引物從水稻中克隆得到OsHOX6基因啟動子，以常規(guī)品種‘IR64’作為水稻材料，含GUS雙元載體pCAMIA1302 的LBA4404根癌農(nóng)桿菌菌系用于轉基因。限制性內切酶，T4DNA連接酶等均由Invitrogen公司購買，載體構件中使用的是DH50大腸桿菌菌株。表1，圖1

表1 引物序列
Table 1 Primers sequence

上游引物Upstreamofprimer序列(5'-3')Sequence(5'-3')下游引Downstreamofprimer序列(3'-5')Sequence((3'-5')HPT-FGCCTGACCTATTGCATCTCCHPT-RAATTGCCGTCAACCAAGCTCOsHOX6-FGTGGATGATGATGGACGTTGOsHOX6-RGCGAGCTTCTCCTTCTTGAG

圖1 植物表達載體pCAMBIA1302-OsHOX6+GUS-Nos3的T-DNA結構
Fig.1 Structure of T-DNA region in plant binary vector of pCAMBIA1302-OsHOX6+GUS-Nos3

1.2 方 法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導的轉化

將未成熟種子的外殼去掉，消毒后在超凈工作臺內，從種子里分離出未成熟的胚并N6培養(yǎng)基上，以農(nóng)桿菌進行侵染后，在25℃，黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，置于選擇培養(yǎng)基上持續(xù)培養(yǎng)5 d，誘導出抗性愈傷組織放到選擇性培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d，篩選出健康的綠色愈傷組織，置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d長出綠色分化苗，將幼苗轉移到有生根培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)至生根，移栽至花盆鍛苗15 d后，移到溫室培養(yǎng)[15]。

1.2.2 轉基因水稻PCR鑒定

采用快速提取DNA試劑盒方法提取總DNA，根據(jù)潮霉素基因組序列與OsHOX6基因設計引物HPT-F,和HPT-R，OsHOX6-F和OsHOX6-R。表1

1.2.3 GUS組織化學染色

將轉基因水稻苗和野生型水稻苗的根、莖、葉和花器官剪下置于1.5 μL離心管中，加入Gus染色液，37℃染色4 h；取出材料，轉入75%酒精中脫色2～3次；肉眼或者顯微鏡下觀察染色結果。

2 結果與分析

2.1 OsHOX6轉基因水稻的PCR鑒定

采用兩對特異性引物對T0代的轉基因水稻植物進行PCR鑒定。研究表明，Hpt1和Hpt1擴增出529 bp的目標片段; OsHOX6特異性引物可擴增出280 和350 bp兩條片段；使用Hpt primer進行PCR檢測時候，轉基因水稻的幼苗擴增出一條與預期大小一致的片段，使用OsHOX6引物進行PCR檢測，轉基因水稻幼苗中擴增出兩條與預期大小一致的片段，而對照野生型水稻中只有一條帶。圖2，圖3

圖2 用HPT primer轉基因植株PCR
Fig.2 Using HPT primer confirm positive plant

圖3 用OsHOX6 primer 轉基因植株 PCR陽性檢測陽性檢測
Fig.3 using OsHOX6 primer confirm positive plant

2.2 Gus 基因在不同組織的特異性表達

對水稻的花粉、花藥、種皮和葉片均進行染色后發(fā)現(xiàn)，Gus目標基因在水稻的花粉和部分受傷處均能表達，但在水稻種皮和葉片的椰肉部分未見表達，目標基因能在花藥與花粉等生殖細胞中表達，同時在損傷部分與葉脈中也表達。圖4

2.3 Gus 基因在根內皮層的特異性表達

經(jīng)過染色實驗發(fā)現(xiàn)水稻的側根能被染色，且染色均勻，OsHOX6啟動子能夠在水稻的側根進行特異性表達。通過對側根的解剖結構進行分析可以看出，側根維管束內皮層均被染均勻的藍色，OsHOX6啟動子在側根的維管束內皮層內能夠進行特異性表達。圖5

3 討 論

植物HD-Zip轉錄因子又可以分為四大亞類(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，HD-Zip 家族轉錄因子亞家族I、II，基因表達干旱，高鹽，ABA和冷害等環(huán)境的誘導，這兩類基因參與基因信號途徑，通過與激素途徑基因與下游基因互作來調控植物細胞擴增，分裂與分化，從而提高植物的耐逆性。HD-Zip 轉錄因子可以調控植物特有發(fā)育進程，其中包括細胞分化和形態(tài)建成等。在早期的研究中己經(jīng)了解到水稻的根系發(fā)育與眾多外界因素息息相關，尤其植物激素。研究表明，生長素在促進不定根、側根生長、維管組織分化、向性反應等過程中起著非常關鍵的作用。水稻HD-Zip轉錄因子亞家族I的OsHOX6基因啟動子在水稻內皮層中特異性表達。水稻具有較為復雜和發(fā)達的根系結構和不同的根系類型，包含胚胎初生根、冠根和側根，冠根可以繼續(xù)分化產(chǎn)生兩種類型的二級根，大側根和小側根。研究結果表明，OsHOX6基因啟動子主要表達在側根的內皮層，葉片葉脈、花粉與損傷的組織，弄清HD-Zip I轉錄因子OsHOX6基因和啟動子在根系形成與發(fā)育的基因調控網(wǎng)絡方面需要進一步深入研究。OsHOX6基因啟動子在花粉和對水稻機械損傷部位能夠表達，此啟動子在花粉活性和昆蟲對植物的危害機制等方面的研究上具有一定意義。同時在花粉與組織損傷部分表達，HD-Zip I轉錄因子OsHOX6通過調控哪些基因形成根部內皮層干細胞的、分裂和分化以及根內皮層形成有關基因關系需進一步深入研究。

A：Gus基因水稻花藥里的表達 B：Gus基因在水稻花粉里表達 C：Gus基因在損傷部分表達D：Gus基因在葉片葉脈中表達

A：Gusgene expression in rice anther B:Gusgene expression in rice pollen C:Gusgene expression in wound D:Gusgene wound expression

圖4Gus基因特異性的在水稻不同組織中表達
Fig. 4Gusgene specific expression in different tissue

A:Gus基因表達在主根 B：Gus基因在側根 C和 D ：Gus基因在根的內皮層

A：Gusgene expression in main root B:Gusgene expression in lateral root C and D :Gusgene expression in the root endodermis

圖5Gus基因表達在冠根、側根及其內皮層
Fig.5Gusgene expression in the main root 、lateral root and endodermis

4 結 論

IR64中的OsHOX6 啟動子驅動的GUS基因，主要表達在水稻葉片葉脈、損傷部分、側根及根的內皮層，在側根與根內皮層中表達量非常強，在葉片葉肉與果實中未見表達。OsHOX6啟動子在水稻內皮層中特異性表達，一部分表皮細胞的外壁向外延伸形成吸管狀的根毛，根毛的對根的吸水作用極為重要，OsHOX6啟動子在側根內皮層特異性表達并隨著側根的細化，表達量增強，OsHOX6啟動子連接到根的生長有關的基因，把基因特異的表達在根內皮層里，提高作物的吸水能力。 OsHOX6啟動子在機械損傷時也能表達。