耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

劉曉敏 邰文琳

（1云南省中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 云南 昆明 650021）

（2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 云南 昆明 650021）

肺炎克雷伯菌(klebsiellapeneumoniae，Kpn)屬于革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌，廣泛存在于自然界和人類(lèi)上呼吸道，也是常見(jiàn)的條件致病菌，可引起支氣管炎、尿道感染、菌血癥、腹膜炎、肝膿腫、甚至腦膜炎等嚴(yán)重疾病。碳青霉烯類(lèi)抗生素是一種結(jié)構(gòu)與青霉素類(lèi)似的抗生素，抗菌譜廣泛、活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酰胺抗生素，被稱(chēng)為對(duì)抗革蘭陰性細(xì)菌的最后一條防線。我國(guó)上市的碳青霉烯類(lèi)抗生素有5個(gè)品種：亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、比阿培南和厄他培南。碳青霉烯抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)：專(zhuān)指對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌。CRKP分離率逐年增多，根據(jù)《2015—2016年CHINET的檢測(cè)報(bào)告》CRKP在腸桿菌科中的檢出率增加至15%左右[1]。這種超級(jí)細(xì)菌通常只對(duì)少數(shù)抗生素敏感，給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來(lái)了極大的困難。感染這種超級(jí)細(xì)菌的患者死亡率很高，在美國(guó)一項(xiàng)關(guān)于針對(duì)CRKP測(cè)序研究中發(fā)現(xiàn)，可歸責(zé)于CRKP感染的死亡率竟高達(dá)33%[2]。根據(jù)XuL等人的調(diào)查，2462名感染CRKP的患者的總死亡率為42.14%，而在世界范圍內(nèi)，北美、南美、歐洲和亞洲的研究報(bào)告的死亡率分別為33.24、46.71、50.06和44.82%[3]。根據(jù)TianX等人的調(diào)查，大多數(shù)的CRKP來(lái)自下呼吸道和泌尿道感染，并且大多數(shù)感染者住院，尤其是ICU患者，大部分合并有其他疾病，導(dǎo)致感染主要風(fēng)險(xiǎn)因素包括：碳青霉烯類(lèi)和第三代頭孢菌素的廣泛使用、機(jī)械通氣、鼻胃導(dǎo)管和中央靜脈導(dǎo)管等有創(chuàng)性治療措施導(dǎo)致。2018年國(guó)家醫(yī)政醫(yī)管局發(fā)布了《碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》，規(guī)范化了碳青霉烯類(lèi)抗生素的應(yīng)用原則，包括：嚴(yán)格控制適應(yīng)癥、規(guī)范該抗生素在兒童和特殊人群中的應(yīng)用、以及加大感控力度、專(zhuān)檔管理、主動(dòng)篩查等措施[2]。如能主動(dòng)進(jìn)行篩查攜帶者和感染者，對(duì)提高患者治愈率和降低死亡率有著積極的作用。

1.碳青霉烯抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌菌CRKP的耐藥機(jī)制

大量研究表明CRKP的耐藥機(jī)制是多因素聯(lián)合作用的結(jié)果。最主要有：產(chǎn)碳青霉烯酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或AmpC酶聯(lián)合孔膜蛋白缺失或低表達(dá)、主動(dòng)外排機(jī)制、以及生物被膜形成等多因素聯(lián)合的耐藥機(jī)制。有研究表明產(chǎn)酶是主要導(dǎo)致耐藥的機(jī)制，而孔膜蛋白缺失聯(lián)合超廣譜-β內(nèi)酰胺酶或AMC酶導(dǎo)致的耐藥能使碳青霉烯類(lèi)MIC值降低，在耐藥機(jī)制中起到了重要的輔助性作用[3]。

1.1 超廣譜-β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）或AMC酶合并孔膜蛋白缺失或低表達(dá)導(dǎo)致的耐藥機(jī)制

超廣譜-β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是一種能夠有效水解β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的酶，作用范圍廣泛，包括第三代頭孢菌素（頭孢哌酮、頭孢曲松等）和單環(huán)酰胺類(lèi)（氨曲南等）抗生素，但此酶可以被加酶抑制劑（如克拉維酸、他唑巴坦等）所抑制。超廣譜-β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的基因型主要包括TEM、SHV、CTX-M、PER和VEB等類(lèi)型，世界流行以TEM型和SHV型最常見(jiàn)，我國(guó)則以CTX-M-15最常見(jiàn)。AmpC酶是一種頭孢菌素酶，不被克拉維酸等酶抑制劑所抑制，只對(duì)四代頭孢和少量抗生素敏感。按照Ambler分子分類(lèi)法（按氨基酸和核酸序列分類(lèi)）AmpC酶屬于C類(lèi)，由AmpC基因編碼產(chǎn)生。AmpC酶分為由染色體介導(dǎo)，和由質(zhì)粒介導(dǎo)兩種類(lèi)型。染色體介導(dǎo)的AmpC酶包括誘導(dǎo)型和結(jié)構(gòu)型兩種，誘導(dǎo)型可在有誘導(dǎo)性的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素（頭孢西丁、亞胺培南、頭孢孟多等）作用下，導(dǎo)致基因ampc的強(qiáng)表達(dá)。兩種類(lèi)型的主要機(jī)制都是通過(guò)ampc基因?qū)崿F(xiàn)的，主要有拷貝數(shù)增加、轉(zhuǎn)錄增加、或獲得插入序列中含有強(qiáng)啟動(dòng)子等機(jī)制。1988年首次發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶MIR-1，至今已有40余種基因型。目前世界范圍內(nèi)最流行的基因型是CMY-2，與CMY-2有關(guān)的質(zhì)粒有IncI1，IncF，IncF-IncI，IncA/C和IncR。我國(guó)肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的AmpC酶主要基因型是DHA基因型。肺炎克雷伯菌的兩個(gè)主要孔膜蛋白名叫OmpK35、OmpK36，由各自同名的基因編碼，MarkG.Wise等人的研究發(fā)現(xiàn)，約83.0%對(duì)厄他培南不敏感的分離株中存在ompK35和ompK36的基因突變。在厄他培南的MIC值最高(＞4mg)的菌株中，60.5%的兩個(gè)孔蛋白基因都發(fā)生了突變。與厄他培南敏感對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)90.4%的菌株存在一種主要OmpK孔膜蛋白的缺乏或低表達(dá)。

1.2 碳青霉烯酶

碳青霉烯酶是一種能高效水解碳青霉烯類(lèi)抗生素的酶，它是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐碳青霉烯類(lèi)抗生素最主要、最重要的機(jī)制。大部分產(chǎn)酶的菌株仍然對(duì)粘菌素、替加環(huán)素等少數(shù)抗生素敏感，但有些細(xì)菌甚至對(duì)這些藥物具有耐藥性。根據(jù)Ambler分類(lèi)的碳?xì)涿瓜┟钢饕茿類(lèi)、B類(lèi)金屬β-內(nèi)酰酶和D類(lèi)碳青霉烯酶。A類(lèi)碳?xì)涿瓜┟钢饕ǎ篕PC、SME、NMC-A、IMI、GES、SFC-l等，其中由質(zhì)粒編碼的KPC酶是最常見(jiàn)的酶，該酶的編碼基因可位于質(zhì)粒、整合子等可移動(dòng)的基因元件上，可在不同菌種（屬）間傳播。KPC-1酶是最早被發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶，2001年美國(guó)亞特蘭大喬治亞州CDC中心YigitH，QueenanAM等人報(bào)道了一個(gè)新型的β-內(nèi)酰胺酶，這個(gè)基因就是等電點(diǎn)pl6.7的KPC-1。隨后各國(guó)和地區(qū)都相繼報(bào)道了產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌在本地區(qū)的流行情況。QiY等人通過(guò)分析來(lái)自中國(guó)5個(gè)省9個(gè)城市13所醫(yī)院的95株碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)所有的耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的菌株均產(chǎn)生了KPC-2酶。根據(jù)FuP等人的研究也證實(shí)了肺炎克雷伯菌ST11是產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌的主要克隆類(lèi)型。而這種耐藥基因能夠通過(guò)質(zhì)粒等移動(dòng)元件在同種甚至不同種屬的細(xì)菌間傳播，可能是導(dǎo)致其蔓延原因。也有研究表明KPC酶僅能使菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的敏感性下降，多表現(xiàn)為低水平耐藥，而高水平耐藥常有其他耐藥機(jī)制共同存在。根據(jù)IoannisGaldadas等人對(duì)A類(lèi)碳青霉烯酶KPC-2的結(jié)構(gòu)研究可得知，A類(lèi)酶具有一個(gè)空間結(jié)構(gòu)上高度保守的區(qū)域，稱(chēng)為“疏水網(wǎng)絡(luò)”，正是這些結(jié)構(gòu)保持了該酶的穩(wěn)定性。并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了如果能破壞這些空間折疊結(jié)構(gòu)就能使酶的功能喪失，從而使耐藥性喪失。隨著2014年阿維巴坦在美國(guó)上市，相繼有頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥菌株報(bào)道，此研究的新療法提供了另一個(gè)抗耐藥菌新思路。B類(lèi)碳青霉烯酶是金屬酶，因其活性部位結(jié)合有金屬離子鋅Zn，金屬離子在酶中起到催化作用。包括IMP、VIM、NDM、GIM、SIM、SPM、AIM等型別，其中以IMP、VIM型為主，其中我國(guó)產(chǎn)IMP的肺炎克雷伯菌以IMP-4、IMP-8型為主。以世界范圍的流行情況來(lái)說(shuō)，產(chǎn)VIM金屬酶的肺炎克雷伯菌以VIM-1、4、5、23基因型為主。近年來(lái)新金屬酶被不斷報(bào)道，新的金屬酶基因型相繼被報(bào)道，2018年BrinkacLM等在尼日利亞的一所醫(yī)院兒科分離到了一株NDM-5。

1.3 D類(lèi)碳?xì)涿瓜┟?/h3>

OXA酶Ambler分子分類(lèi)法屬于D類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶，由于其對(duì)于苯唑西林、氯唑西林有很強(qiáng)的水解能力，且不被克拉維酸所抑制，因此命名為OXA型酶。至今已報(bào)道了91種OXA型酶。其中世界范圍以O(shè)XA-48最為常見(jiàn)，該酶由blaOXA-48基因編碼，是地中海地區(qū)分布最廣泛的碳青霉烯酶。根據(jù)西班牙一項(xiàng)研究表明西班牙CRPK中碳青霉烯酶OXA-48型占91.38%。但根據(jù)MarianaCastanheira等人的報(bào)道歐洲地區(qū)近年來(lái)OXA-48及其變異體檢出呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，從4.3%增加到2014-2016年的12.6%。

1.4 外排機(jī)制的作用

肺炎克雷伯菌目前發(fā)現(xiàn)的主要外排系統(tǒng)是AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)，由周質(zhì)融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB構(gòu)成。該系統(tǒng)存在于肺炎克雷伯菌內(nèi)膜上，通過(guò)主動(dòng)外機(jī)制排消耗能量將抗菌藥物、消毒劑等排出細(xì)菌外，導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)的藥物、消毒劑的濃度減低，無(wú)法發(fā)揮滅菌作用。研究表明肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和酰胺醇類(lèi)抗生素耐藥與主動(dòng)外排系統(tǒng)AcrAB-TolC的關(guān)系密切，是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生多重耐藥性的重要原因。肺炎克雷伯菌的AcrABTol外排泵基因主要有oqxA.oqxB.emrD.tehA.mdfA及qacE1-△sull等。根據(jù)鄭軒的研究，約93%的多重耐藥的肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶多種外排泵基因。根據(jù)馬建新、徐燕等的研究，外排基因中qacE1-△sull和mdfA檢出最多，分別達(dá)到了95%和85%。

1.5 生物被膜形成

生物被膜可以在細(xì)菌表面生成，可能協(xié)同孔膜蛋白和外排系統(tǒng)對(duì)抗生素起到抵抗和減少胞內(nèi)濃度的作用。生物被膜在肺炎克雷伯菌中檢出率非常高，達(dá)90%以上，多重耐藥菌與非多重耐藥菌生物膜形成能力并沒(méi)有明顯差異，但生物膜的形成能夠促進(jìn)外排基因AcrA的表達(dá)，使得排外作用的增強(qiáng)。根據(jù)俊田學(xué)斌、劉海洋等的研究表明：肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與luxS基因表達(dá)量有關(guān)，luxS可能是一個(gè)高階調(diào)控基因，可調(diào)控很多病原菌的生物膜形成，該基因與外排泵基因ramA、孔膜蛋白基因ompK36和調(diào)控基因micF等基因構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)，共同影響生物膜的形成。

2.總結(jié)和展望

綜上所述，CRKP耐藥主要機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，而高水平的耐藥和泛耐藥是由于多因素的作用而導(dǎo)致的，這個(gè)復(fù)雜多變的機(jī)制導(dǎo)致了臨床治療非常困難，而很多酶基因的編碼基因位于可轉(zhuǎn)移基因元件上，易導(dǎo)致耐藥基因在同種或不同菌種間傳播，造成嚴(yán)重的院內(nèi)交叉感染和耐藥菌爆發(fā)擴(kuò)散，是醫(yī)院感染和爆發(fā)流行的潛在隱患，不容忽視。如果能提前篩查攜帶者和感染患者，對(duì)ICU等提高有合并癥患者治愈率和降低死亡率有著十分積極的作用。