固定化菌劑的制備及其對含油土壤的修復(fù)研究

張琪雯 周飛 陳嘯

摘 ?????要：選取前期實驗中從長慶油田措施廢液集中處理后殘渣中篩選的3株高效石油烴降解菌D1、D2、D5作為研究對象，采用吸附法制備固定化菌劑，制備過程的最佳條件為：秸稈和草炭固定化菌劑的最佳固定化時間均為36 h，木炭的最佳固定化時間為30 h;秸稈固定化菌劑和草炭固定化菌劑的最優(yōu)載體加入量為3.0 g/100 mL菌懸液;木炭固定化菌劑的最優(yōu)載體加入量為2.0 g/100 mL菌懸液。秸稈固定化的最佳pH為7.0，草炭和木炭固定化的最佳pH為7.5;三種載體固定化菌劑的最佳固定化溫度均為35 ℃。在未滅菌的含油土壤40 d的室內(nèi)原位模擬修復(fù)過程中，各固定化菌劑對石油烴的降解率大小依次為：草炭固定化菌劑74.12%>木炭固定化菌劑70.25%>秸稈固定化菌劑60.74%>游離混合菌35.48%>不加菌對照11.98%。在滅菌的含油土壤的修復(fù)過程中，幾種處理方式對石油烴的降解率大小依次為：木炭固定化菌劑70.75%>草炭固定化菌劑69.90%>秸稈固定化菌劑68.28%>游離混合菌44.30%>不加菌對照2.21%。

關(guān) ?鍵 ?詞：固定化菌劑;微生物修復(fù);復(fù)合菌群

中圖分類號：X53 ???????????文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）02-0251-05

Abstract： Three high-efficiency petroleum hydrocarbon degrading bacteria， D1， D2， and D5， isolated from the residue after concentrated treatment of Changqing oilfield wastewater in the previous experiment were selected as research objects. Immobilized microbial agents were prepared by adsorption method， and the best preparation conditions were determined as follows： the optimal immobilization time was 36 h for straw and peat as a carrier and 30 h for charcoal; The optimal carrier dosage for straw， peat and charcoal to immobilize microbial agent were 3.0， 3.0 and 2.0 g per 100 mL bacterial suspension; The optimal pH for immobilization of straw， peat and charcoal were 7.0， 7.5 and 7.5; The optimal immobilization temperature for all three kinds of carriers was 35 ℃.During indoor simulation repairing of unsterilized oily soil for 40 d by using immobilized bacteria agents， the degradation rates of the petroleum hydrocarbons were as follows： peat immobilized bacteria agent 74.12% > charcoal immobilized bacteria agent 70.25% > straw immobilized bacteria agent 60.74% > free mixed bacteria 35.48% > control treatment （non-added bacteria） 11.98%. In the period of remediation of sterilized oily soil， the degradation rates of petroleum hydrocarbons were as follows： charcoal-immobilized microbial agent 70.75%> peat- immobilized microbial biomass agent 69.90%> straw immobilized microbial agent 68.28%> free-mixed bacteria 44.30%> control treatment （non-added bacteria） 2.21%.

Key words： Immobilized microbial agents; Microbial repair; Complex flora

含油土壤是指由于在油田采油及運輸途中，由于不正常的操作或其他事故等造成的落地原油與泥土或其他雜質(zhì)形成的含油固體廢物[1]。針對含油土壤的治理，國內(nèi)外提出了較多的處理方法以及工藝流程，但因含油土壤成分和性質(zhì)較為復(fù)雜，每種治理方法都存在一定的局限性。微生物降解技術(shù)因其成本較低、操作簡便、無二次污染、效果好等特點而被廣泛采用。石油是一種由各種烴類和非烴類物質(zhì)構(gòu)成的復(fù)雜化合物。微生物對于烴類化合物的降解有各自的局限性，通常單個菌株只能降解一定范圍內(nèi)的石油烴，并且降解代謝過程往往是分步進(jìn)行的，復(fù)合菌群是由具有相互協(xié)同促進(jìn)的多種菌株組成的群體，利用不同菌株的協(xié)同作用，擴(kuò)大底物的范圍，可以較好的提高石油烴的降解效率，則可形成一個完整高效的降解系統(tǒng)[2]。由于石油烴污染修復(fù)的降解菌大部分都是游離菌，降解過程中因為污染物的成分復(fù)雜，產(chǎn)生的一些次生代謝產(chǎn)物和中間產(chǎn)物具有較大的毒性，而且很難被微生物所降解。因此，固定化技術(shù)被逐漸引入土壤的修復(fù)中來[3]。

吸附法是一種比較簡單的固定化方法，因其具有固定操作簡單、反應(yīng)條件較溫和、固定化成本低等多重優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于含油土壤和廢水的治理 [4]。本文制備了三種固定化復(fù)合菌劑并對其性能進(jìn)行了研究。

1 ?實驗部分

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?菌種來源

實驗室前期從含油土壤中篩選出的的3株高效石油烴降解菌株：D1（Bacillus sp.）、D2（Streptococcus sp.）和D5（Alcaligenes sp.）。

1.1.2 ?培養(yǎng)基的制備

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基（NH4NO3 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，無水CaCl2 0.02 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，NaCl 5.0 g）。在上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入0.5%原油即可得原油液體培養(yǎng)基，再添加一定比例瓊脂即可得原油固體培養(yǎng)基。

1.1.3 ?試劑與儀器

石油醚、Na2HPO4、NH4Cl和無水硫酸鈉皆為分析純。紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.1.4 ?載體來源

秸稈：陜西省渭南市某縣收集;木炭：購置于廣州科駱爾生物能源科技有限公司;草炭：購置于遼寧清原泥炭土加工廠。以上載體經(jīng)通風(fēng)陰干后用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，備用。

1.2 ?實驗方法

1.2.1 ?固定化復(fù)合菌劑的制備

將3株單菌的菌懸液分別按照正交優(yōu)化條件下的最佳的接種比例混合即可制得混合菌懸液;分別稱取2.0 g的三種載體，加入到裝有100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min。接入6 mL混合菌懸液，150 r/min，30 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)36 h后，用雙層紗布進(jìn)行過濾，并用滅菌的生理鹽水進(jìn)行洗滌2～3次，即可得固定化復(fù)合菌劑[5]。

1.2.2 ?原油降解率的測定

原油降解率的測定采用超聲萃取-紫外分光光度法進(jìn)行測定。在無菌條件下，接入固定化的復(fù)合菌劑至裝有100 mL滅菌的原油液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)7 d后，加入25 mL石油醚，超聲波萃取其中的石油，此步驟重復(fù)3次，將上層液合并轉(zhuǎn)至分液漏斗，收集上層萃取液，過濾后進(jìn)行定容，以石油醚作為空白參比，測定OD值，計算含油率，與初始的含油量作對比，計算原油降解率[6]。

1.2.3 ?固定化菌劑與載體、載體-菌液混合物的降解對比實驗

首先準(zhǔn)備10組已滅菌的100 mL原油液體培養(yǎng)基，在其中分別加入6 mL混合菌液、2.0 g載體（3種）、2.0 g載體（3種）與6 mL混合菌液的混合物、2.0 g載體固定化菌劑（3種），150 r/min，30 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)5 d，測定原油降解率。

1.2.4 ?最佳固定化時間的確定

稱取2.0 g三種載體，接入6 mL混合菌液之后，150 r/min，30 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)18、24、30、36、42、48 h后，制得固定化菌劑，將其加入100 mL原油液體培養(yǎng)集中，30 ℃，150 r/min水浴搖床震蕩培養(yǎng)5 d，測定原油的降解率，以判斷最佳固定化時間。

1.2.5 ?最佳固定化載體的量的確定

分別稱取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g載體，接入6 mL混合菌液，150 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，得固定化菌劑。加入100 mL原油液體培養(yǎng)基，150 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，測定原油的降解率。

1.2.6 ?最佳固定化pH的確定

2.0 g載體，接入6 mL混合菌液之后， pH調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，150 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)18、24、30、36、42、48 h，制得固定化菌劑。將其加入100 mL原油液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min水浴搖床震蕩培養(yǎng)5 d，測定原油的降解率。

1.2.7 ?最佳固定化溫度的確定

稱取2.0 g三種載體，接入6 mL混合菌液之后，分別置于不同溫度恒溫?fù)u床中培養(yǎng)36 h后，制得固定化菌劑，將其加入100 mL原油液體培養(yǎng)集中，30 ℃，150 r/min水浴搖床震蕩培養(yǎng)5 d，測定原油的降解率。

1.2.8 ?固定化復(fù)合菌劑對含油土壤的修復(fù)

將配置好的5%的原油濃度的供試土壤200 g放入100 mL燒杯中。在含油土壤中加入10%的各種固定化復(fù)合菌劑，每個處理設(shè)3個平行對比實驗。含油土壤分為滅菌組和未滅菌組不同處理。30 ℃培養(yǎng)40 d，每2 d補(bǔ)加無菌水，使其含水率保持在35%左右，每天翻動土壤。分別在0、5、10、15、20、25、30、35、40 d，四分法取樣測定原油降解率。

1.2.9 ?土壤中石油烴含量的測定

將降解后的含油土壤風(fēng)干后磨碎，稱取2.0 g試樣置于50 mL比色管中，加入25 mL石油醚超聲15 min，過濾收集濾液至50 mL燒杯中，再加入20 mL石油醚進(jìn)行超聲波提取，合并提取液至100 mL容量瓶中，紫外測定含油濃度。降解率計算如下：

石油烴降解率（%）=%

式中：W0—降解前的石油烴濃度，mol/mL;

W1—降解后的石油烴濃度，mol/mL。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?固定化菌劑與載體、載體-菌液混合物的降解效果的對比

由圖1可以看出，降解率最高的是草炭固定化菌劑，達(dá)到了92.02%，再依次是木炭固定化菌劑和秸稈固定化菌劑，降解率分別為89.28%和85.25%，均高于單獨投加載體和載體-菌液混和物的降解率。

2.2 ?最佳固定化時間的確定

不同固定化時間制得的固定化菌劑，原油降解效果如圖2所示。

由圖2可以看出，三種載體固定化菌劑的原油降解率均呈先升高再下降的趨勢。秸稈和草炭固定化菌劑的最佳固定化時間均為36 h，原油降解率最高達(dá)到了87.46%和87.07%;木炭的最佳固定化時間為30 h，原油降解率為83.89%。

2.3 ?最佳固定化載體的量的確定

不同載體的量制得的固定化菌劑，降解效果如圖3所示。

從圖3可以看出，秸稈固定化菌劑和草炭固定化菌劑達(dá)到最高降解率時，秸稈和草炭的投加量為3.0 g;木炭固定化菌劑達(dá)到最高降解率時，木炭的最佳投加量為2.0 g。

2.4 ?最佳固定化pH的確定

不同pH條件制得的固定化菌劑，降解效果如圖4所示。

從圖4可以看出在pH為7.0的時候，秸稈固定化菌劑的原油降解率最大，達(dá)到了87.77%，在pH為7.5時，木炭固定化菌劑和草炭固定化菌劑的原油降解率達(dá)到最大，分別為81.39%和89.08%。偏酸或者偏堿的環(huán)境一方面會影響載體的吸附效果，也會影響到微生物自身的生長。中性偏堿性環(huán)境有利于微生物的生長代謝，吸附作用也較強(qiáng)。

2.5 ?最佳固定化溫度的確定

不同溫度下制得固定化菌劑原油降解效果如圖5所示。

由圖5可以看出，以秸稈、木炭和草炭為載體的固定化菌劑的固定化溫度為35 ℃時，原油降解率均達(dá)到最佳，分別為89.08%、81.79%和91.12%。溫度過低或過高時，微生物的生長代謝活性程度不高，從而使得降解率下降。

2.6 ?修復(fù)過程微生物對含油土壤降解率的影響

以不加入混合菌劑的土壤組作為空白對照，含油土壤高壓滅菌和不滅菌兩種不同的處理方式對其進(jìn)行為期40 d室內(nèi)模擬修復(fù)，其降解變化趨勢的結(jié)果如圖6和圖7所示。

由圖6可以看出，未滅菌的含油土壤由于土著微生物的作用，不加菌的對照組的原油降解率隨著時間的增長而緩慢增加，在降解40 d后的最大降解率只達(dá)到了11.98%。游離混合菌的降解率也隨著時間的增加而增長，但是降解率相對于滅菌組較低，可能是由于土著微生物對土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的競爭作用，使得游離混合菌的生長受到限制，其最高降解率達(dá)到了35.48%。[7] 三種載體的固定化菌劑中，草炭的降解率最高，達(dá)到了74.12%，可能是因為草炭載體是由沼澤植物的殘體堆積形成的，質(zhì)地較為松軟易于分散，有機(jī)質(zhì)含量較高，菌體可吸附的比表面積較大，大大地促進(jìn)了菌體與原油的接觸面積，也提供較多的營養(yǎng)物質(zhì);木炭載體的表面也具有較大的孔狀結(jié)構(gòu)可供微生物附著，它的吸附能力也較強(qiáng)，提供了較大的微生物與原油的接觸面積，對含油土壤的降解率達(dá)到了70.25%;秸稈載體的吸附能力較前兩種載體的吸附性弱，表面較為光滑，微生物的附著能力較差，40 d時的降解率達(dá)到最高，為60.74%。[8]未滅菌組的石油烴的降解率大小依次為：草炭固定化菌劑>木炭固定化菌劑>秸稈固定化菌劑>游離混合菌>不加菌對照。

由圖7可以看出，載體固定化菌劑對石油烴的去除效率高于不加菌的對照組和游離的混合菌。

不接菌的對照組的降解率很低并且在降解過程中石油烴含量幾乎無變化，降解率的些許升高可能是由于石油烴的自然揮發(fā)。游離混合菌對石油烴的降解率隨著時間的增加而增加，0～10 d的石油烴降解率增加的速率較小、10～25 d的石油烴的降解率增加較快，原因是在修復(fù)的前期，碳源豐富，微生物大量繁殖，對石油烴的消耗較快，25～40 d時，營養(yǎng)物質(zhì)消耗，微生物的代謝強(qiáng)度下降，且石油烴中易于降解的烴類被大量利用，原油的降解速率相對趨于穩(wěn)定，最后其最大降解率達(dá)到了44.30% [9]。在對混合菌進(jìn)行固定化后，降解率提高較大，木炭和草炭的固定化菌劑降解效果要優(yōu)于秸稈固定化菌劑。木炭和草炭這兩種載體具有較大的比表面積，對原油有著較強(qiáng)的吸附能力，能夠加快原油的去除效率。秸稈的表面較為光滑致密，傳質(zhì)性能較差，使得微生物吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力降低。[10]在降解進(jìn)行到40 d的時候，三種載體固定化菌劑對原油的去除效率均達(dá)到最大，其中木炭固定化菌劑達(dá)到了70.75%，草炭和秸稈固定化菌劑也分別達(dá)到了69.90%和68.28%。滅菌組的石油烴的降解率大小依次為：木炭固定化菌劑>草炭固定化菌劑>秸稈固定化菌劑>游離混合菌>不加菌對照。

3 ?結(jié) 論

吸附法固定化菌劑的制備過程的最佳條件為：秸稈和草炭固定化菌劑的最佳固定化時間均為36 h，木炭的最佳固定化時間為30 h;秸稈固定化菌劑和草炭固定化菌劑的最優(yōu)載體加入量為3.0 g/100 mL菌懸液;木炭固定化菌劑的最優(yōu)載體加入量為2.0 g/100 mL菌懸液;秸稈固定化的最佳pH為7.0，木炭和草炭固定的最佳pH為7.5;三種載體固定化菌劑的最佳固定化溫度均為35 ℃。

對未滅菌含油土壤進(jìn)行40 d的室內(nèi)原位模擬修復(fù)過程中，各固定化菌劑對石油烴的降解率大小依次為：草炭固定化菌劑74.12%>木炭固定化菌劑70.25%>秸稈固定化菌劑60.74%>游離混合菌35.48%>不加菌對照11.98%。在滅菌的含油土壤的修復(fù)過程中，幾種處理方式對石油烴的降解率大小依次為：木炭固定化菌劑70.75%>草炭固定化菌劑69.90%>秸稈固定化菌劑68.28%>游離混合菌44.30%>不加菌對照2.21%。

參考文獻(xiàn)：

[1]李啟鋒. 采油現(xiàn)場含油污泥處理工藝及裝置研究[D]. 西安： 西安石油大學(xué)， 2017.

[2]劉天璐.含油污泥對水體的污染及凈化試驗研究[D].杭州：浙江大學(xué)， 2017.

[3]彭香玉. 石油降解混合菌的構(gòu)建及其固定化修復(fù)污染土壤的研究[D]. 西安：陜西科技大學(xué)， 2015.

[4]王博. 土壤石油降解菌的篩選與微生物生態(tài)修復(fù)研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

[5] 李政，趙朝成，張云波，等.耐熱石油降解混合菌群的降解性能研究[J].化學(xué)與生物工程.2012，28（12）：37-42.

[6]趙延君. 固定化石油降解菌劑的制備及除油效果研究[D].濟(jì)南： 濟(jì)南大學(xué)， 2014.

[7]Deqian Huang， Quan Xu， Jiongjia Cheng， et al. Electrokinetic remediation and its combined technologies for removal of organic pollutants from contaminated soils[J]. Int. J. Electrochem. Sci.， 2012， 7：4528-4544.

[8]Pareja L， Pérez-Parada A， Agüera A， et al. Photolytic and photocatalytic degradation of quinclorac in ultrapure and paddy field water： Identification of transformation products and pathways[J]. Chemosphere，2012， 87（8）：838-844.

[9]張可， 陳強(qiáng)， 陳偉，等. 玉米芯、竹炭及油枯吸附-海藻酸鈉包埋施氏假單胞菌PFS-4對二氯喹啉酸的降解[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2017， 28（2）：643-650.

[10]Wu J C， Zhang X L， Zhao Y， et al. Screening of Biosurfactant-Producing Thick Oil-Degrading Bacteria and its Degradation Effect[J]. Advanced Materials Research， 2013， 821-822：1027-1030.